Vibrio natriegens 粗提细胞裂解液的制备

在预冷的缓冲液中取一悬液 Vibrio natriegens，该菌具有较高的蛋白质合成速率，使用预冷缓冲液可防止细胞降解。

在低温条件下离心。

弃去上清液以去除污染物。

用少量预冷的缓冲液重悬沉淀。

使用宽孔吸头将悬液转移至微量离心管中，以防止机械剪切。

混匀悬浮液，并将试管放入置于冰上的试管架中。

将超声破碎仪的探头插入悬浮液中。

启动超声处理以破坏细胞膜并释放胞质内容物。

离心以分离不溶性细胞碎片。

将含有胞质成分的上清液或粗制细胞提取物收集到新的离心管中。

用液氮速冻细胞提取物，以保持其生物活性。

将样品储存于超低温条件下，以用于后续的无细胞蛋白表达。

将新配制的 S30 裂解缓冲液（pH 7.7）冷却至约 4 摄氏度。用 10 毫升该冷 S30 裂解缓冲液重悬来自同一升培养物的所有沉淀，并将悬液转移至 50 毫升离心管中。在 4 摄氏度下以 3,500 × g 离心 10 分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀，将沉淀置于冰上。

在冷室中操作，向置于冰上的50毫升离心管中的沉淀物加入500微升预冷的S30裂解缓冲液。使用宽口移液枪头重悬沉淀，并小心转移至另一置于冰上的2毫升离心管中。为了获得活性很高的粗提物，必须确保细胞在S30缓冲液中不过度稀释，同时含有足够液体以保证超声处理的效率。

取一个600毫升烧杯，装满冰，并将一个2毫升试管架放在冰上。短暂涡旋振荡试管，使细胞均匀悬浮。轻弹试管，去除管盖底部附着的细胞，然后将试管开口朝上放入试管架中。

将超声波破碎仪的探头尖端插入管中的细胞悬液，使其刚好位于液面下方。使用超声波破碎仪和直径为1/8英寸的探头准备超声处理装置。将超声波破碎仪设置为20千赫兹频率、50%振幅，脉冲开启时间为10秒，脉冲关闭时间为60秒。

进行三次脉冲超声处理，然后在4°C条件下，以16,000 × g离心粗细胞提取物30至45分钟，直至裂解液中无任何细胞碎片。

在进行超声处理的同时，目视检查细胞裂解情况至关重要，以确保超声处理达到预期效果。

在低温室中操作，将所得上清液各50微升分装至新的2毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。为快速冷冻这些粗制细胞提取物，将离心管放入带有浸入式提绳的管架中，并浸入装有液氮的杜瓦瓶内。