0 次观看 • 4:37 分钟 • October 30th, 2025
取一培养物，为丝状蓝细菌 Phormidium lacuna。
将培养物均质化以分散菌丝，然后离心以沉淀细菌。
弃去上清液，并将沉淀重悬于营养丰富的培养基中。
将含有绿色荧光蛋白和抗生素抗性基因的质粒DNA添加到添加了抗生素的琼脂平板上。
将细菌悬液加入DNA上，并在光照条件下孵育。
细菌利用IV型菌毛将DNA内化。导入的基因会整合到细菌基因组的多个拷贝之一中。
将细菌重新涂布于含有抗生素的琼脂平板上，以筛选转化后的细菌。
在光学显微镜下，识别健康且呈绿色的丝状体，以确认转化成功。
将筛选出的菌丝转移到含有更高抗生素浓度的液体培养基中，以富集转化后的菌群。
再次将它们接种到含有更高抗生素浓度的琼脂平板上，以分离转化子。
在荧光显微镜下观察GFP表达，以确认转化成功。
取1毫升处于对数生长期的P. lacuna丝状体，分别接种于两个装有50毫升液体F2培养基的250毫升锥形瓶中。在25摄氏度、白光条件下振荡培养约5天。
五天后，将100毫升P. lacuna细胞悬液在10,000 RPM下均质化3分钟，并在750纳米处测定其光密度。随后，将细胞悬液在6,000 × g下离心15分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于800微升剩余液体及额外的F2+培养基中。取八块含有120微克/毫升卡那霉素的F2+ Bacto琼脂平板，用移液器将10微克DNA加入每块琼脂平板的中央。
立即用移液器将100微升细胞悬液加至DNA上方。将无盖的琼脂平板置于超净工作台上，使多余的液体蒸发。盖上平板，在25摄氏度的白光条件下培养两天。
两天后，用接种环将每个琼脂平板上的丝状体转移至多个含有120微克/毫升卡那霉素的新鲜F2+ Bacto琼脂平板上。将平板置于25摄氏度的白光条件下培养，并定期在显微镜下观察培养物。14至28天后，在显微镜下识别已死亡的棕褐色丝状体，并寻找已转化的丝状体。
转化后的丝状体呈现健康绿色，与大量未转化的丝状体不同。将每根单独的转化丝状体转移至含有10毫升添加250微克/毫升卡那霉素的F2+培养基的50毫升锥形瓶中。在25摄氏度、白光条件下于摇床培养，并观察其生长情况，持续长达四周。
将菌丝转接到含有 250 微克/毫升卡那霉素的琼脂培养基上，等待菌丝生长。随后再次提高卡那霉素浓度以加速分离过程。对于 GFP 表达的观察，使用荧光显微镜在 40X 或 63X 放大倍数下观察单个菌丝，并采集明场透射光图像和荧光图像。