丝状蓝藻Phormidium lacuna的自然转化和GFP表达

以 Phormidium lacuna 为例，这是一种丝状蓝藻。

均质培养物以分散细丝，然后离心以沉淀细菌。

弃去上清液并将沉淀重悬于营养丰富的培养基中。

将含有绿色荧光蛋白和抗生素耐药基因的质粒DNA添加到补充抗生素的琼脂平板上。

将细菌悬浮液添加到DNA上，并在光照条件下孵育。

细菌使用 IV 型菌毛内化 DNA。引入的基因整合到细菌基因组的多个拷贝之一中。

将细菌重新分布到补充抗生素的琼脂平板上以选择转化的细菌。

在光学显微镜下，识别表明成功转化的健康绿色细丝。

将选定的细丝转移到具有更高抗生素浓度的液体培养基中，以富集转化的群体。

再次，将它们接种到抗生素水平较高的琼脂上，以分离转化体。

在荧光显微镜下可视化 GFP 表达以确认转化成功。

首先将 50 毫升液体 F2 培养基与来自运行培养物的 1 毫升 P. lacuna 细丝接种到两个 250 毫升烧瓶中的每一个中。在25摄氏度的搅拌下在白光下培养约五天。

五天后，以10,000 RPM均质100毫升腔 隙疟原虫 细胞悬液三分钟，并在750纳米处测量光密度。然后，以6,000倍g离心细胞悬液15分钟。除去上清液并将沉淀悬浮在 800 微升剩余液体和额外的 F2+ 培养基中。取八个含有每毫升卡那霉素 120 微克的 F2+ Bacto 琼脂平板，并将 10 微克 DNA 移液到每个琼脂平板的中间。

立即在DNA顶部移液100微升细胞悬液。将没有盖子的琼脂板放在干净的工作台上，让多余的液体蒸发。合上盘子，在25摄氏度的白光下培养两天。

两天后，将每个琼脂板的细丝分布到几个新鲜的F 2 + Bacto琼脂平板上，其中含有每毫升120微克卡那霉素，并带有接种环。在25摄氏度的白光下培养板，并在显微镜下定期检查培养物。14 至 28 天后，识别死去的褐色细丝，并在显微镜下寻找转化的细丝。

转化后的细丝看起来健康、绿色，与大部分细丝不同。将每根转化的细丝转移到装有 10 毫升 F2+ 培养基和 250 微克/毫升卡那霉素的 50 毫升烧瓶中。在摇床上在 25 摄氏度的白光下培养，观察生长长达 4 周。

将细丝转移回含有每毫升卡那霉素250微克的琼脂培养基中，等待细丝生长。然后，再次增加卡那霉素浓度以加速分离。对于GFP表达，用荧光显微镜以40倍或63倍放大倍率观察单丝，并捕获明场透射图像和荧光图像。