通过同源重组在蓝细菌中产生抗生素标记突变体

从一培养物的蓝细菌开始。

离心培养物，然后轻柔洗涤沉淀，以保护细菌表面的菌毛。

再次离心，将沉淀重悬于新鲜培养基中，并转移至试管。

引入一种带有抗生素抗性基因的非复制型载体。该基因两侧为与细菌基因组中目标基因上下游区域同源的DNA序列。

孵育以使菌毛介导质粒进入细胞，该质粒与同源序列对齐，并通过重组替换目标基因，从而引入突变。

将细胞涂布于琼脂平板上并进行培养，使抗生素抗性基因表达出抗性蛋白。

在含有抗生素的琼脂表面覆盖一层琼脂，并进行培养。突变细胞中的抗性蛋白可使抗生素失活，从而促进其存活和菌落形成。

挑取存活的菌落，并在含有抗生素的琼脂平板上重新划线，以分离抗生素抗性突变株。

按照文本方案准备好培养基、蓝细菌菌株和质粒后，用接种环取一环蓝细菌细胞接种于30至50毫升BG11培养基中，建立新鲜培养物。

在30摄氏度光照条件下培养两至三天，至OD₇₅₀ 等于 0.2 至 0.6。

孵育结束后，将1至2毫升培养物在2,300 ×g下离心5分钟。然后弃去上清液，用BG11培养基洗涤沉淀一次，轻轻吹打重悬细胞，避免使用涡旋振荡，因为涡旋可能导致对DNA摄取至关重要的菌毛丢失。

再次离心收集细胞并去除上清液后，加入 BG11 培养基至终体积 100 微升，并将细胞转移至 14 毫升圆底管中。接着，向细胞中加入 1 微克预先制备好的质粒 A，轻轻敲击混匀。

然后将试管水平放置于30摄氏度的培养箱中，培养4至6小时。培养结束后，将细胞培养物与质粒DNA混合物的等分试样涂布于不含抗生素的BG11琼脂平板上，于30摄氏度继续培养。

约24小时后，将卡那霉素溶于水中，配制0.6%的琼脂溶液，并使其冷却至42摄氏度。然后将2.5至3毫升该溶液加入培养皿的边缘，并倾斜培养皿，使溶液在表面形成均匀的顶层琼脂层。

将平板培养约七天，直至菌落可见。然后将一块新的添加了卡那霉素的 BG11 琼脂平板分为六个区域，用钝头牙签挑取单菌落进行划线分离。