0 次观看 • 2:54 分钟 • November 28th, 2025
取表达带有聚组氨酸标签目标蛋白的细菌细胞悬液。
在冰上进行超声处理，以最大限度减少蛋白质降解。高频声波可裂解细胞，释放胞内成分，包括目标蛋白。
离心以分离碎片，并将含有蛋白质的上清液转移至注射器中。
过滤上清液以去除聚集体，防止堵塞色谱柱。
取一个镍基亲和层析柱，并进行平衡以实现最佳蛋白质纯化。
将滤液上样到色谱柱中。聚组氨酸标签会与柱内树脂上的镍离子结合，从而使目标蛋白固定在柱上。
用缓冲液洗涤层析柱以去除未结合的蛋白质，并监测洗脱液的紫外吸光度，以确认非目标蛋白质已被去除。
加入含有咪唑的洗脱缓冲液，咪唑可与多聚组氨酸标签竞争镍离子结合位点，从而释放目标蛋白。
紫外吸收的第二次峰证实了目标蛋白的洗脱，该蛋白已可用于后续实验。
在冰上对细胞进行超声处理，采用五个循环，每个循环包括15秒脉冲和30秒暂停。
将细胞裂解液在 21,000 g、4 摄氏度条件下离心 15 分钟后，使用无菌注射器滤器系统过滤上清液。采用配备 5 毫升镍基亲和层析柱的自动化纯化系统，从经无菌过滤的 E. coli 上清液中纯化 HIS 标签的 RTA 组分。通常情况下，洗脱速度设为每分钟 1 毫升，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及毒素活性丧失。
用 20 毫升结合缓冲液短暂平衡亲和柱，以去除保存缓冲液。然后，使用注射器将无菌过滤的上清液加载到亲和柱上。用 25 至 35 毫升结合缓冲液洗涤柱子，以去除未结合的蛋白质。
重复洗涤步骤，直至280纳米处的紫外吸光度接近初始紫外值。然后用20至35毫升洗脱缓冲液洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存。应在紫外280值开始上升后尽快开始收集RTA组分，并在该值重新回到原始基线时停止收集。