通过选择性裂解营养细胞从环境样品中分离内生孢子

采集含有产芽孢细菌的营养细胞和芽孢以及其他细菌的环境样本。

芽孢具有保护性外膜，有助于其在恶劣环境中存活。

使用真空过滤装置，过滤样品以将细胞和芽孢截留在滤膜上。

将膜放入培养皿中，并剪成小片。

将样品转移至离心管中，加入缓冲液，振荡离心管以释放细胞和芽孢。

在高温下振荡孵育，以削弱营养细胞结构，同时不破坏芽孢。

冷却样品，然后加入溶菌酶并振荡孵育。溶菌酶可破坏营养细胞的细胞壁，导致细胞破裂。

加入氢氧化钠和去垢剂，孵育以降解细胞大分子和碎片，同时保留坚韧的内生孢子。

过滤样品以分离内生孢子。洗涤内生孢子以去除过量试剂，为其后续分析做好准备。

按照文本方案准备好滤膜装置和真空泵后，使用经乙醇火焰灭菌的镊子将无菌硝酸纤维素膜放入滤膜装置中。将刚制备的上清液样品的一半加入膜过滤装置中，并使用真空泵将细胞收集到膜上。当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵。

使用无菌镊子小心取出滤膜，并将其放入无菌培养皿中。用一片新的无菌滤膜，对剩余一半溶液重复过滤操作。为了从刚收集的生物量中分离芽孢和营养细胞，若滤膜曾冷冻保存，需先将其解冻，并用乙醇火焰灭菌的剪刀将滤膜剪成较小的片段。

将膜片段转移至无菌的2毫升离心管中，加入900微升1倍浓度TE缓冲液。通过涡旋充分混匀，使生物量从膜上释放。在65摄氏度、80转/分钟条件下孵育10分钟。

然后，将离心管从培养箱中取出，静置冷却15分钟。加入100微升新鲜配制的溶菌酶，使其终浓度为2毫克/毫升，并将样品在37摄氏度、80转/分钟条件下孵育60分钟，以裂解营养细胞。裂解完成后，向样品中加入250微升3摩尔/升氢氧化钠溶液和250微升6%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。在室温、80转/分钟条件下孵育60分钟。

接下来，通过高压灭菌制备一个可容纳25毫米直径滤膜的无菌过滤装置。待过滤装置冷却后，将一个直径为25毫米、孔径为0.2微米的硝酸纤维素膜放置其上。

将样品加入膜上，并使用真空泵过滤液体，使芽孢截留在膜上，而营养细胞物质则通过膜。