JoVE 实验百科全书
微生物学
0 次观看 • 2:38 分钟 • November 28th, 2025
首先将一个比色皿放入配备有温控比色皿架和搅拌器的荧光分光光度计中。
加入预热的缓冲液，调节至中等酸性 pH，并设置 holder 温度以模拟应激条件。
在测试样品中加入源自 E. coli 的耐酸保护伴侣蛋白。
在对照样品中，加入等体积的缓冲液。
接下来，将一种对温度和酸敏感的底物蛋白分别引入两个样品中。
开始监测光散射。
在胁迫条件下孵育样品，以诱导底物去折叠。
在中等酸性 pH 条件下，分子伴侣被激活并稳定去折叠的蛋白质。
加入pH中和盐溶液，并继续记录光散射。
在对照样品中，恢复至中性 pH 值会导致去折叠的蛋白质发生聚集，从而增加光散射。
在测试样品中，分子伴侣促进底物的重新折叠，导致与对照组相比光散射降低。
比较光散射信号以评估分子伴侣活性。
将一个1 mL石英比色皿放入配备有温度控制样品架和搅拌器的荧光分光光度计中。
将激发波长和发射波长设置为350纳米。向比色皿中加入适量体积的预热缓冲液D，调节至所需pH值。总体积为1,000微升。
将比色皿 holder 的温度设置为 43 摄氏度。向缓冲液中加入 12.5 微摩尔 HdeB，随后加入 0.5 微摩尔 MDH。开始监测光散射。
将反应孵育360秒，以充分展开MDH。加入0.16至0.34体积的2摩尔未缓冲磷酸二钾溶液，将pH值升至7，继续记录光散射440秒。按照文本方案中所述方法分析数据。