检测转基因细菌细胞中靶酶的表达

从含有基因改造细菌细胞的试管开始。每种细菌都携带编码多种酶的高拷贝fosmid质粒。

振荡培养试管，以促进各种细胞内酶的表达。

向试管中加入针对目标酶的特异性底物，并向对照管中加入等体积的缓冲液。

振荡孵育。底物进入细胞后，被靶酶切割，生成荧光产物。

将对照管加入已预校准的流式细胞仪中。

当每个细胞通过激光束时，会散射光线。生成散点图以识别单个细胞，单个细胞的散射光强度低于细胞团块。

排除细胞团块，绘制单个细胞的荧光信号以建立基础荧光水平。

将经过底物处理的试管放入流式细胞仪中，以检测荧光信号。

与对照细胞相比，底物处理细胞中荧光信号的增强表明目标酶的表达。

为了筛选目标宏基因组酶，将分选后的细胞在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育，直至OD₆₀₀达到0.5。然后加入1微升拷贝数诱导溶液，以扩增细胞内fosmid的拷贝数。

在37摄氏度、250转/分钟条件下孵育3小时后，取0.5毫升细胞与适量底物加入14毫升圆底试管中，使底物终浓度为100微摩尔。随后将对照组和实验组样品在37摄氏度、200转/分钟条件下继续孵育3小时。

在样品振荡的同时，按照刚才演示的方法设置流式细胞仪的参数。然后，从每个样品中取5 µL细胞，分别加入含有1 mL PBS的5 mL圆底试管中。接下来，上样并设置事件速率为每秒1000至3000个事件。

创建一个对数缩放的前向散射面积与对数缩放的侧向散射面积的散点图，并调整R1散射门以包含单细胞事件的细菌细胞。然后创建一个对数缩放的前向散射与对数缩放的FITC面积散点图，并设置R2分选门，使少于0.1%的阴性细胞被检测到。现在，加载样品管，并根据需要将事件速率重新调整为每秒1000至3000个事件。