小鼠肠道切片中肠道细菌的荧光原位杂交

首先，将含有针对细菌 16S rRNA 的特异性荧光原位杂交（FISH）探针的溶液加入到载玻片上，该载玻片上含有定植了细菌的小鼠肠道组织切片。

放置盖玻片以铺展含有探针的液体并防止蒸发。

将玻片置于加湿的孵育盒中，在较高温度下孵育。

这会解开RNA的二级结构，促进探针与细菌16S rRNA中的互补序列杂交。

移除盖玻片，并将载玻片孵育于预热的洗涤缓冲液中，以去除未结合的探针。

用磷酸盐缓冲液冲洗，以维持生理 pH 值。

加入含有黏液特异性染料和细胞核染料的复染剂，并进行孵育。

这些染料可选择性地结合肠黏液以及细菌和宿主细胞的 DNA。用缓冲液洗涤载玻片，并使用封片介质将盖玻片封固在载玻片上。

在共聚焦显微镜下，观察切片中标记了FISH的细菌、肠细胞以及黏液层。

使用液体阻断剂或PAP笔在每个组织切片周围绘制非常紧密的圆圈，以限制杂交溶液需要覆盖的扩展区域，避免墨水接触切片。

制备杂交溶液，并为每使用50微升溶液加入0.5微克的探针。将溶液移液至载玻片上的切片区域。用柔性塑料盖玻片覆盖切片，确保所用液体体积能够完全覆盖整个切片区域。

使用移液枪盒和已用过量杂交液或 PBS 浸湿的擦拭纸或纸巾制备一个湿盒，以提供湿度环境。将载玻片置于湿盒中，在 45 至 50 摄氏度下孵育至少三小时（具体时间取决于探针组合），以减少蒸发。移除塑料盖玻片，将载玻片放入预热至 50 摄氏度的 Coplin 染色缸中的 FISH 洗涤缓冲液中孵育。

将 Coplin 染色缸重新放回 50 摄氏度的烘箱中，孵育 10 至 20 分钟。从 Coplin 染色缸中移除 FISH 洗涤缓冲液，并用 PBS 替代。在 Coplin 染色缸中重新加入 PBS 后，立即倾去 PBS。

从染色缸中取出载玻片，将复染液滴加至整个组织切片上，注意移液枪头不要接触组织。在4摄氏度下孵育45分钟。用新鲜的PBS快速洗涤染色液三次。

用擦镜纸或纸巾擦拭载玻片背面，并借助连接移液枪头的真空管线，使组织切片上的大部分 PBS 缓冲液挥发。使用封片剂对切片进行封片。用透明指甲油沿盖玻片边缘涂抹，将盖玻片固定于载玻片上，注意避免触及载玻片边缘。室温下静置固化。