检测细菌感染小鼠脑组织中靶基因的表达

取自感染致病菌的小鼠脑组织中提取的总RNA。该提取物含有感染应答基因的转录本。

加入DNA降解酶，孵育以降解残留的基因组DNA。

加入含有逆转录酶（RT）、核苷酸和非特异性引物的预混液。

孵育以合成互补DNA（cDNA）。

引入高温以灭活逆转录酶。

取含有DNA聚合酶、核苷酸、双链DNA结合染料以及针对目标基因的特异性引物的预混液。

加入cDNA并加热使DNA变性。

引物结合到目标 cDNA，从而启动新的 DNA 链合成。

重复该循环以扩增目标基因。

染料与扩增的DNA结合并发出荧光，该信号在每个循环结束时被记录。

荧光增强证实了感染小鼠脑组织中感染响应基因的表达。

使用浮游状态细胞或生物膜状态细胞感染所有小鼠，并按照文本方案中所述实施安乐死。随后，使用RNA提取试剂盒从脑组织中提取总RNA。

每只小鼠使用全脑组织提取 RNA。将全脑组织分成五份，分别放入五个管中。每管加入不超过 100 毫克的脑组织，并向含有试剂盒所提供裂解矩阵的每管中加入 1 毫升裂解液。

按照文本方案中列出的步骤提取RNA。接下来，使用配备反转录试剂盒的热循环仪进行cDNA合成，并包括基因组DNA的消除步骤。将1微克RNA加入含有2微升5倍浓度基因组DNA消除缓冲液和1微升基因组DNA消除酶的离心管中。

加入无RNase水，直至体积达到10 µL。在42 °C下孵育2分钟。向反应溶液中加入10 µL主混合液，然后轻轻混匀。

立即进行逆转录反应，将离心管置于37摄氏度下15分钟。随后将反应体系转移至85摄氏度持续5秒。使用实时荧光定量PCR仪和Cyber定量实时PCR试剂盒进行定量实时PCR分析。根据试剂盒说明书，混合酶、引物、50倍ROX参比染料二以及cDNA模板，然后加入无RNase的水，直至总体积达到20微升。

使用文本方案中列出的热循环参数对每个样本进行三复孔检测，并基于2-ΔΔCT法计算相对表达倍数变化。