新生小鼠脾脏吞噬细胞体外杀菌活性评估

0 次观看3:42 分钟 • January 30th, 2026

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首先通过机械法解离新生小鼠脾脏,以制备单细胞悬液。

将悬液转移至离心管中,离心并弃去上清液。

用裂解缓冲液重悬沉淀,以去除红细胞。

加入缓冲液,再次离心,并移除上清液。

将细胞重悬于缓冲液中,并与针对中性粒细胞和炎性单核细胞表面表达的受体的抗体包被磁珠共同孵育。

离心并去除未结合的磁珠。加入缓冲液,然后将悬液通过铁磁柱,并施加磁场以保留与磁珠结合的细胞。

撤去磁场,用缓冲液洗脱细胞,并将细胞接种至多孔板中。

向选定的孔中加入浓度逐渐增加的发光细菌。

孵育以使中性粒细胞和单核细胞通过吞噬作用内化细菌。

更换为含抗生素的培养基,以清除未被内化的细菌。

定期记录发光情况,以评估吞噬作用介导的细菌内化及后续杀伤效果。

进行体外细菌杀伤实验时,将未感染的脾脏置于含有5毫升PBS(添加10%胎牛血清)的无菌60毫米培养皿中的40微米尼龙筛网上,用无菌3毫升注射器活塞将组织研磨成单细胞悬液。将细胞转移至15毫升离心管中,通过离心收集细胞。每3至4个脾脏,用1毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。

室温孵育5分钟后,用PBS洗涤脾脏,并将沉淀重悬于250微升PBS中,PBS中添加牛血清白蛋白和2毫摩尔EDTA,用于细胞计数。接着,根据生产商说明书,使用相应的免疫磁珠分离Ly6 B2阳性细胞,并将富集的Ly6 B2阳性细胞以每100微升完全培养基接种1×10⁵个细胞的密度,接种至黑色或白色96孔板中。在每孔终体积为100微升的条件下,制备所需感染复数的细菌接种物,然后向每孔加入100微升细菌接种物或单独培养基,在细胞培养孵箱中孵育1小时。

孵育结束时,将培养基更换为200微升新鲜的完全培养基,其中添加100微克/毫升的庆大霉素,以清除任何残留的胞外细菌,然后将细胞放回细胞培养箱中继续孵育2小时。此后在每次实验时间点结束时,使用酶标仪在将培养板放回细胞培养箱进行下一次读数前,测量带盖培养板中每个孔的发光信号。

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最后更新:22 八月 2026