小鼠牙龈组织切片中细菌的原位检测

取一段感染致病菌且经过预处理以获取细菌 DNA 的小鼠牙龈组织切片。

加入含有地高辛标记的DNA探针的缓冲液，该探针靶向细菌DNA。

放置盖玻片并封固，以防止样品脱水。

加热使DNA变性，然后在高温高湿条件下孵育，以促进探针杂交。

将载玻片冷却并移除盖玻片，用缓冲液多次洗涤以去除未结合的探针。

加入封闭液以防止抗体的非特异性结合。

加入与地高辛结合的酶偶联抗体进行孵育。

洗涤以去除未结合的抗体。

加入一种抑制剂以选择性地使内源性酶失活。

加入一种能与酶反应产生有色沉淀物的底物。

用水冲洗以去除多余的底物。

加入染料以染色细胞核。

洗涤以去除多余的染料。

使用乙醇脱水，并用二甲苯处理以增加组织透明度。

封片。

在显微镜下观察切片内的细菌。

首先将切片浸入2x SSC溶液中20分钟，以开始原位杂交实验。在此期间，用杂交缓冲液将标记的探针稀释至每微升1纳克。作为阴性对照，使用未标记探针，浓度为标记探针的10倍。随后，将探针在90摄氏度下加热10分钟以进行变性，然后迅速置于冰上冷却。

接下来，向每张切片加入与蛋白酶K相同体积的探针稀释液。然后，小心地盖上盖玻片，并用指甲油密封切片。将切片置于PCR仪的加热块上，在90摄氏度加热10分钟，随后转移至45摄氏度的湿化培养箱中过夜孵育。

第二天，将载玻片在4摄氏度下冷却半小时，然后小心地移除盖玻片。组织较为脆弱。最后，将载玻片在室温下依次通过一系列SSC缓冲液。

用 MABT 缓冲液清洗原位杂交切片 5 分钟。然后加入 50 至 400 微升含 1% Tween 20 的封闭液，室温孵育 20 分钟。封闭结束后，加入 50 至 400 微升封闭液稀释的抗 DIG 碱性磷酸酶抗体（1:1000），孵育。

在37摄氏度下孵育90分钟。一抗孵育结束后，用MABT缓冲液洗涤切片10分钟。随后，将切片置于含1% Tween 20的检测缓冲液中，孵育5分钟。

现在向每张载玻片上加入 50 至 400 微升检测缓冲液中含 1 毫摩尔的左旋咪唑溶液，孵育 5 分钟以灭活内源性碱性磷酸酶。接着，向每张载玻片加入 50 至 400 微升用检测缓冲液按 1 至 100 稀释的 NBT/BCIP 溶液，在湿盒中孵育 2 至 3 小时，具体时间根据经验确定。

用去离子水冲洗载玻片。然后加入0.05%（质量体积比）的甲基绿，于37摄氏度对组织进行复染10分钟。再次用去离子水冲洗载玻片，随后用100%乙醇脱水，再浸入二甲苯中。最后，加入80 µL封片剂，盖上盖玻片。