制备 农杆菌 植物细胞基因递送的培养方法

从一株在添加了两种抗生素的培养基中培养的Agrobacterium tumefaciens菌液开始，以防止污染并确保质粒的保留。

细菌含有携带目的基因和抗生素抗性基因的植物表达载体。

它们还包含一种辅助质粒，该质粒具有毒力基因区域，对于将目的基因递送至植物细胞是必需的。

取一部分转入含有缓冲培养基的离心管中，该培养基中添加有乙酰丁香酮（一种植物来源的信号分子）以及抗生素。振荡培养。

乙酰丁香酮扩散进入细胞，触发信号通路，并激活毒力基因的表达，从而促进目的基因的转移。

转移培养物，离心收集细菌，并弃去上清液。

加入盐缓冲液并反复洗涤细胞，以去除添加的抗生素。

将细菌重悬于含有乙酰丁香酮的缓冲液中，并在不摇动的条件下孵育，以维持毒力基因的表达。

为实现高效转化，请立即使用该培养物。

用枪头从LB平板上挑取一个阳性菌落，将菌体接种到含有5毫升LB培养基的玻璃试管中，LB培养基中添加50微克/毫升卡那霉素和50微克/毫升利福平。在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养24至48小时。

将100微升培养物转移至5毫升LB培养基中，LB培养基中添加相同的抗生素、10毫摩尔MES（pH 5.6）和20微摩尔AS。在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养细菌16至20小时。在4,000 × g 10分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬于2毫升10毫摩尔氯化镁缓冲液中。

重复洗涤以确保完全去除抗生素。通过测量600纳米处的光密度来确定农杆菌（Agrobacterium）培养物的密度。用10毫摩尔/升氯化镁缓冲液调节细胞培养物，使其OD₆₀₀达到1.5至2.0。

向最终的悬浮培养物中加入 pH 5.6 的 10 毫摩尔 MES 和 150 微摩尔 AS，并在室温下静置孵育细胞至少 3 小时。