荧光标记细菌中染色体分离的延时成像

从含有表达荧光标记染色体复制起点和荧光微球的细菌的金属框架上的营养琼脂糖垫开始。

琼脂糖垫支持细菌的附着和运动，荧光微球则作为参考标记用于追踪染色体分离。

在倒置宽场显微镜的预热培养箱中，向物镜添加镜油。

将样品置于物镜上方，然后聚焦于一个包含多个细菌及至少一个荧光微球的区域。

启动延时成像，同时采集相差图像和荧光图像。

荧光标记的复制起点在细胞一端附近呈现为明亮的簇状结构。

分裂过程中，复制起点发生复制；其中一个拷贝保留在细胞原有的末端，而另一个拷贝则迁移至新形成的细胞末端。

该实验装置能够追踪染色体在多次分裂过程中的分离情况，并可加以改进以观察其他细菌中类似的动态过程，包括病原菌在与宿主相互作用期间的行为。

为了进行延时显微成像，打开显微镜并启动显微镜控制软件。选择合适的物镜以及正确的反射镜和滤光片，以获取相差图像以及绿色荧光、红色荧光或黄色荧光蛋白的图像。在物镜镜头上滴加一滴高质量的浸油，并将预热至32摄氏度的样品底部也滴加浸油。

将带有样本的金属框放置在显微镜载物台上，使孔的一面朝向物镜，然后用载物台夹具牢固固定样本。通过沿Z方向移动载物台使其靠近物镜，从而对细胞进行聚焦。当物镜和样本上的油接触时，沿X/Y方向移动载物台。

切换到 Metamorph 软件并打开采集工具。在“设置”下拉列表中选择“相差对比”，并将曝光时间设置为 100 毫秒。点击“显示实时图像”，将细胞移入焦平面，并在 X/Y 方向上移动载物台，直到视野中可见多个单个细胞。

确保视野区域内至少有一个荧光微球，以便后续对采集的图像进行对齐。接着，打开显微镜控制软件中的多维采集向导，设置一个延时实验，使显微镜能够根据需要在多个波长和载物台位置采集图像。

在主选项卡中，启用延时成像和多波长模式。窗口左侧将出现额外的选项卡。点击“保存”选项卡，然后选择目录，指定计算机硬盘上的一个空文件夹以保存采集的图像，并启用“文件存在时递增基础名称”选项，以确保连续的数据集不会覆盖之前的数据。为实验命名，名称中应包含日期以及菌株名称或实验标题。

单击延时摄影选项卡以调整延时参数，然后将时间间隔设置为20分钟，将持续时间设置为24小时。时间点的数量将自动更新。现在，单击波长选项卡。

通过更改数字来选择在每个时间点为每幅图像采集的波长数量。选择“允许每个波长单独记忆硬件自动对焦位置”。点击顶部的“第一波长”选项卡。

在“照明”下拉列表中，选择“相差显微镜”。将曝光时间设为100毫秒，在“采集”下拉列表中选择“每个时间点”。在下拉列表中选择“从不”，以关闭自动曝光；在自动对焦的下拉列表中选择“每次采集”。

使用以下参数，按照刚才演示的方法为每个波长设置曝光。然后，在“主”选项卡中，启用“多阶段位置”以从多个阶段位置获取图像。单击“阶段”选项卡，再单击“实时”按钮以查看视野。

移动载物台的 X/Y 方向，直到目标区域进入视野。在“载物台”选项卡中点击加号保存当前的 X 和 Y 坐标。再次移动载物台的 X/Y 方向，直至找到新的目标区域，并再次点击加号保存坐标。

继续操作直至保存所需数量的区域。通过点击已保存的不同X和Y位置，再次检查细胞是否处于焦点。点击AFC保持以启动硬件自动对焦，从而在实验过程中保持保存的Z位置恒定。在显微镜控制软件的多维采集向导中，点击“采集”以开始延时记录。

在延时记录的前几个时间点后，检查细胞是否仍处于焦点位置，以最大限度地提高图像质量，并在需要时重新对焦。