量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

取一块微孔板，其中包含对照孔和处理孔，每孔接种有可形成生物膜的致病性细菌。

处理孔中含有可破坏生物膜形成的酶。

在微厌氧条件下孵育，以建立低氧环境。这会促进细菌分泌介导表面黏附的信号分子。在处理孔中，酶可降解这些分子，从而减少细菌的黏附。

洗涤各孔以去除未贴壁的细胞。

加入新鲜培养基并进行培养。黏附的细菌增殖并分泌胞外聚合物，从而形成生物膜基质。

移除培养基并洗涤孔板。

加入阳离子染料并孵育，使染料与带负电荷的生物膜组分结合。

洗涤以去除未结合的染料。

在搅拌条件下，用溶剂孵育以将结合的染料释放到溶液中。

通过测量光密度（OD）来定量生物膜生物量。

处理孔中较低的 OD 值反映了生物膜形成减少，这是由于初始细胞黏附能力受损所致。

首先，在摇床培养箱中，于30摄氏度下将5毫升的鲍曼不动杆菌S1菌液在LB培养基中培养16小时。

将菌液浓度调整至 OD₆₀₀ 为 0.8。然后用含有每毫升 4 毫克纯化 GKL 酶的新鲜 LB 培养基将菌液按 1:100 的比例稀释，并向 96 孔板的各孔中加入 100 微升。

用盖子盖住培养板，并将其放入一个10升的塑料容器中。密封容器后，在30摄氏度下孵育3小时，然后轻轻移除培养基。向孔中再加入100微升新鲜LB培养基，并将培养板在30摄氏度下继续孵育21小时。

轻轻移除培养基后，用 200 微升无菌水轻柔冲洗浮游细菌细胞。将移液枪枪头置于孔底部，小心吸出液体培养基，以尽量减少对气液界面处生物膜的干扰。然后向每孔中加入 100 微升 1% 结晶紫溶液，在室温下孵育 15 分钟。

用200微升无菌水洗涤各孔三次，以去除结晶紫溶液。每孔加入100微升33%乙酸，轻轻振荡孵育15分钟，使染料溶解。通过测定结晶紫在600纳米处的吸光度来定量生物膜的量。结晶紫的量与形成的生物膜量成正比。