酶介导抑制生物膜形成的显微评估

从两个含有成膜细菌悬液的玻璃底培养皿开始。

处理组培养皿中含有具有活性的信号干扰酶，而对照组则包含失活的酶。

盖上培养皿，孵育以使细菌黏附于微皿表面。

洗涤以去除非贴壁细胞，然后加入含有酶的新鲜培养基并孵育。

在对照培养皿中，细菌通过信号分子进行交流，并产生胞外聚合物（EPS），从而形成生物膜。

该活性酶可降解信号分子，破坏其功能，从而减少生物膜的形成。

更换新鲜培养基，继续孵育以增强酶对生物膜的破坏作用。

移除培养基，加入荧光标记的凝集素，并孵育以使凝集素与胞外多糖（EPS）结合。

洗涤以去除任何未结合的凝集素。

使用固定剂孵育以保存生物膜结构，然后冲洗培养皿。

获取共聚焦显微镜图像，以评估酶介导的生物膜形成抑制作用。

为了对A. baumannii S1 生物膜进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，将A. baumannii S1 接种于 5 毫升 LB 培养基中，在 30 摄氏度摇床培养箱中振荡培养 16 小时。将A. baumannii S1 菌液的 OD₆₀₀ 调整至 0.8。

然后用含有1.2毫克/毫升纯化GKL酶的新鲜LB培养基将菌液按1:100稀释，并取1毫升加入35毫米玻璃底培养皿中。用盖子盖好培养皿，放入10升塑料容器内并密封，于30°C孵育3小时。轻轻移除培养基后，加入含30微升纯化GKL酶的新鲜培养基1毫升，再于30°C继续孵育21小时。

再次轻柔地移除培养基，并更换为1毫升含有GKL酶的新鲜培养基。在30°C下孵育24小时。孵育结束后，轻柔地移除培养基，加入500微升溶于HBSS中的5微克/毫升Alexa Fluor 488标记的小麦胚芽凝集素。

将微皿在37摄氏度下孵育30分钟，以染色生物膜。为固定生物膜，加入500微升溶于HBSS的3.7%甲醛，于37摄氏度孵育30分钟。用2毫升HBSS洗涤微皿一次，然后完全移除溶液。

在共聚焦激光扫描显微成像（CLSM）前，将样品置于4摄氏度避光保存。进行CLSM成像与分析时，使用63倍物镜，每个图像采集97个光学切片，每层间隔为0.21微米。