从感染的宿主细胞中分离胞内病原菌

取病原菌悬液。

将悬浮液加入贴壁培养的骨髓来源巨噬细胞或BMDM细胞中，并进行孵育。

细菌利用其表面蛋白与宿主细胞受体结合，从而促进黏附。

用缓冲液冲洗以去除未黏附的细菌。

加入新鲜培养基并继续培养。

随后，宿主细胞将黏附的细菌内化。

加入抗生素以杀死未被内化的细菌。

弃去培养基，用缓冲液洗涤。

加入预冷的水以裂解宿主细胞，释放细胞内容物、细胞核以及被内化的细菌。

收集细胞裂解液并离心以沉淀细胞碎片。

收集含有细菌的上清液。通过过滤装置过滤，以捕获完整的细菌。

折叠滤纸并将其放入试管中。

用液氮速冻以保持细胞完整性。

置于低温条件下保存以备后续使用。

取0.5毫升洗涤后的细菌悬液，感染每一块巨噬细胞培养板。若使用多块培养板，各次感染应间隔15分钟，以便在感染结束后能够分别单独收获各块培养板。在37°C孵育30分钟后，用PBS洗涤感染细胞两次，以去除未结合的细菌，随后加入30毫升预热的BMDM培养基。

孵育30分钟，使细菌被细胞内化。感染后1小时，加入庆大霉素，使其终浓度为50微克/毫升，以杀灭任何残留的胞外细菌。将滤器头安装在带有真空出口端的收集液瓶上，组装过滤装置。

然后将一个 0.45 微米的滤膜置于滤器头，接着放上圆筒形漏斗，并使用金属夹固定各部件。感染后 6 小时，在收集细菌前，先在显微镜下观察细胞单层。每次仅处理一块培养板以收集细菌，用 PBS 清洗感染的细胞。

然后，为了裂解巨噬细胞，加入 20 毫升预冷的无 RNA 酶水，并迅速而小心地使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将收集的细胞转移至 50 毫升锥形管后，涡旋振荡 30 秒，随后在 4 摄氏度下以 800 × g 离心 3 分钟，以去除巨噬细胞的细胞核。为收集细菌，使用真空系统将上清液通过滤膜过滤。

然后，用镊子将滤膜卷起，迅速转移至一个15毫升的锥形管中。立即使用液氮对管子进行速冻。