从RNA提取 单核细胞增生李斯特菌 从感染的小鼠巨噬细胞中收获

取一支含有滤纸的试管，滤纸上带有Listeria monocytogenes。这些细菌来源于感染的小鼠巨噬细胞。

加入含有 RNase 抑制剂的缓冲液以防止 RNA 降解，然后以多个角度涡旋离心管，使细菌脱落。

离心并将上清液转移至含有苯酚-氯仿-去污剂混合液的离心管中。

涡旋并在较高温度下孵育，以破坏细菌膜、使蛋白质失活并裂解细菌，释放胞内组分。

离心以分离富含 RNA 的水相与其他组分。

收集RNA并将其转移至含有乙酸钠和乙醇的离心管中。

涡旋，然后在低温下孵育。

醋酸钠可中和RNA的负电荷，而乙醇和低温条件则促进RNA沉淀。

离心以沉淀RNA。

移去上清液，并用冷乙醇洗涤沉淀。

再次离心，弃上清，空气干燥后加入无RNase水。

将 RNA 储存以用于后续分析。

将含有滤膜的管子置于冰上解冻，以保持其低温。然后向每根管子中加入 650 微升的冷乙酸盐 EDTA（AE）缓冲液。

应尽快操作，剧烈涡旋滤管，使滤膜甩至管壁周围，同时确保缓冲液充分冲洗滤膜。必要时可倒置管子并进行涡旋，以彻底将细菌从滤膜上冲洗下来。该步骤中最关键的是确保细菌被高效地从滤膜上完全去除。

为此，我们在不同位置多次重复涡旋离心管。待其余样品涡旋处理完毕后，将离心管短暂离心。接下来，将每根离心管中含有细菌的缓冲液转移至含有 SDS 和苯酚-氯仿的离心管中，然后将这些离心管放入多管涡旋仪中，以最高速度涡旋 10 分钟。

然后，将试管置于65摄氏度的加热块中孵育10分钟，随后以最大速度离心5分钟。将水相转移至含有40微升3摩尔醋酸钠和1毫升100%乙醇的新鲜试管中。充分涡旋混匀样品后，将试管于-80摄氏度孵育1小时，或于-20摄氏度过夜。

然后，将样品离心后，小心地从每根离心管中吸除乙醇，再向每个样品中加入500 µL预冷的70%乙醇。涡旋混匀后再次离心样品，随后小心吸除每根管中的乙醇，并使用真空浓缩仪将沉淀干燥2分钟。接下来，向每根离心管中加入25 µL无RNase的水，在室温下孵育20分钟。