基于重组RBD的SARS疫苗方案：蛋白制备、动物免疫与中和检测

在此实验中，制备一种表达SARS-CoV RBD蛋白的重组疫苗，并评估其诱导针对SARS假病毒中和活性的能力。首先，RBD蛋白在转染的293T细胞培养上清液中表达并纯化。纯化后的蛋白用于免疫。

在免疫后不同时间点采集小鼠及免疫血清，以量化免疫血清的中和能力。进行假病毒中和实验，制备表达荧光素酶的重组SARS假病毒，并与梯度稀释的血清样本共同孵育。随后通过检测感染细胞中相对荧光素酶活性，评估这些中和后病毒对表达SARS共受体ACE细胞的感染能力。

随后可计算中和抗体的50%滴度。我叫tu，目前是实验室的一名博士后。

与现有的基于活病毒的中和实验等技术相比，假病毒中和实验的主要优势在于该技术相对安全，无需使用具有感染性的SARS病毒，且可在生物安全二级实验室中进行。我的名字是Demonstrating Procedure，将由杜 laying（DU）进行演示，DU是我实验室的一名博士后研究员，主要致力于针对SARS和流感等新发传染病疫苗的研发工作。请在室温下解冻无菌的2×HBS缓冲液（pH 7.0）、2.5 mol/L氯化钙溶液以及RBD质粒。

溶液解冻后，用无菌5毫升移液管取2毫升2倍HBS缓冲液（2X HBS）加入50毫升锥形管中；另取15毫升离心管，将200微升氯化钙与40微克RBD质粒混合，再用室温无菌去离子水定容至2毫升。将质粒溶液逐滴加入2X HBS缓冲液中，同时保持混合物在温和且持续的涡旋振荡状态。

保持该涡旋缓慢且持续，对于获得适合高效转染的适当稠度沉淀物至关重要。室温下静置 20 分钟。孵育结束后，将混合物逐滴加入含有 50% 至 70% 汇合度的 293T 细胞的培养瓶中。

在40毫升细胞培养基的体积中，重要的是将转染溶液均匀分布。加入转染混合物后立即混匀培养基。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

孵育8至10小时后，移除完全细胞培养基，并加入50毫升新鲜的无血清Opti-MEM I培养基，以避免血清对后续蛋白质纯化的干扰，然后将细胞放回37°C培养箱中继续培养。两天后收集上清液，其中含有表达的RBD蛋白，在6,000 RPM条件下离心15分钟，以去除细胞碎片。细胞沉淀完成后，将上清液转移至新的离心管中，并加入蛋白酶抑制剂混合物。

为防止蛋白质降解，按照制造商说明使用镍-NTA Superflow柱从收集的上清液中纯化RBD重组蛋白，并用含有250毫摩尔氯化钙的缓冲液洗脱RBD蛋白。接下来，使用Amicon Ultra 15离心管，在4°C、3000转/分钟条件下离心约15分钟，浓缩含有氯化钙的纯化蛋白。弃去滤过液。

向RBD浓缩管中加入PBS，然后在4°C条件下以3000 RPM再次离心20分钟。重复洗涤两次。为确保彻底去除残留物，将纯化后的蛋白质溶解于PBS中，并用移液器将蛋白质转移至干净的1.5毫升EOR离心管中。

最后，使用NanoDrop以PBS作为空白对照，测定纯化后蛋白质的浓度，并将样品在-80摄氏度保存。首先，向一支Sigma佐剂系统小瓶中加入1毫升无菌PBS。在40至45摄氏度水浴中预热，并充分涡旋振荡小瓶2至3分钟。

接下来，在一个1.5毫升的离心管中制备蛋白佐剂乳剂。将用PBS稀释的适量解冻纯化蛋白与等体积的佐剂系统混合，剧烈涡旋振荡2至3分钟。同时，通过将佐剂与PBS单独混合来制备对照乳剂。皮下注射。

在初次接种后21天，对至少五只4至6周龄的BC小鼠进行皮下注射，每只注射200微升初免混合液，每剂含20微克蛋白，或注射对照乳剂。加强免疫剂量为每200微升终体积中含有10微克蛋白，每只小鼠注射一次。在初次免疫前及每次接种后10天，采集每只小鼠的血液样本，分离血清后于-20摄氏度保存。

转染前16小时，将补体在56摄氏度下灭活30分钟，然后以每皿200万个细胞的密度在100毫米组织培养皿中接种293T细胞。按照前述方法制备转染试剂，并将编码SARS-CoV S蛋白的质粒与另一编码env缺陷型、可表达荧光素酶的HIV-1基因组的质粒共同转染至细胞中。转染后8至10小时。

更换为含有10%血清的10毫升新鲜DMEM培养基，然后将细胞放回培养箱中。两天后，收集含有SARS假病毒的上清液。将上清液通过0.45微米的一次性注射器滤器过滤，以去除细胞碎片，并分装病毒。

立即使用，或使用多通道移液器板在负80摄氏度下冷冻以备将来使用。在96孔组织培养板中接种表达SARS-CoV受体ACE2的293T细胞，每孔100微升含10,000个细胞，并将细胞在37摄氏度下孵育16小时。使用另一个96孔板对表达重组荧光素酶的SARS假病毒进行滴定，并在第一块板的A和B行中确定中和试验所需的合适病毒浓度。

每孔加入 150 微升含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基。接着，向 A1 和 B1 行的孔中加入 150 微升未稀释的病毒，然后通过将第 1 行各孔中的 150 微升转移至下一行孔中，依次进行重复的两倍系列稀释，直至第 11 行。弃去最后 150 微升，第 12 行不加病毒。

在完成连续稀释并使 ACE 2 93 T 细胞孵育 16 小时后，通过将病毒孔板中每孔的 100 微升液体转移至含有细胞的对应孔中来感染细胞。在 37 摄氏度下将细胞孵育两天，以使病毒侵入细胞。使用超 3 84 发光仪读取孔板，测定每个孔中的感染水平。

感染量与荧光素酶活性强度成正比。在中和试验中，将使用病毒浓度，使得相对荧光素酶单位（RLU）约为第12列中仅细胞背景RLU的上千倍。首先在另一块96孔板中进行中和反应，使用多通道移液器向第1列各孔加入150微升含10%胎牛血清的DMEM培养基，向其他各列孔中加入120微升。

接下来，使用多通道移液器将待检测的每种小鼠血清各 3 µL 加入第一列的复孔中。本示例中，前两个孔加入的是来自 RBD 免疫小鼠的 50 倍稀释血清，接下来的两个孔为另一只 RBD 免疫小鼠的血清，最后四个孔为两只有 PBS 对照免疫动物的血清。通过将第一列所有孔中的 30 µL 液体转移至第二列孔中，依次进行五倍系列稀释，重复此操作直至第 11 列。

弃去剩余的30微升，使第12列的孔中不含血清。接着，向每个孔中加入120微升稀释后的SAR假病毒。将培养板置于37摄氏度孵育1小时，使小鼠血清中的抗RBD抗体能够结合并中和SARS假病毒。

孵育结束后，从每个孔中转移100微升中和后的病毒至相应孔中，该孔位于含有表达ACE2的293T细胞的96孔板中。将细胞在37摄氏度孵育24小时，以允许感染发生。一旦细胞被感染，使用多通道移液器吸出旧培养基，并更换为每孔100微升的新鲜培养基。

72 小时后将培养板放回 37 摄氏度的培养箱中。再次移除上清液。此时，任何未被小鼠血清中和的假病毒应已能够感染细胞。使用多通道移液器，每孔加入 60 µL 荧光素酶细胞裂解液。

将培养板置于室温下的摇床上，使细胞裂解1至2小时。细胞裂解完成后，取50 µL细胞裂解液加入96孔化学发光仪检测板中，每孔加入50 µL荧光素酶底物。使用Ultra 3 84化学发光仪，设置为96孔板发光检测模式，读取各孔信号，以评估不同孔中相对的荧光素酶活性，进而推算出病毒中和百分比。

这些数据表明，达到的病毒中和百分比与RBD免疫小鼠血清的浓度成正比。相比之下，注射PBS的动物血清在任何浓度下均无法中和病毒。可轻松推导出中和50%病毒所需的NT50或血清滴度。

在尝试该实验操作时，重要的是要牢记信心和耐心对实验成功至关重要。观看这些视频后，您应能更好地理解如何在哺乳动物细胞系中表达重组SARS疫苗，以及如何确定其在小鼠模型中诱导中和抗体反应的能力。