建立用于研究口腔致病机制的细菌–真菌跨域生物膜

以口腔致病菌Streptococcus mutans和机会性真菌病原体Candida albicans的培养物开始实验。

将分离的菌落转移至营养丰富的培养基中，过夜培养以确保菌体活跃生长。

离心以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于无菌生理盐水中，调整至指定浓度。

取一个涂有唾液溶液的多孔板，以模拟口腔环境。

加入C. albicans，孵育以使细胞附着于唾液涂层。用无菌生理盐水洗涤，去除未黏附的细胞。

加入热灭活血清并孵育以诱导菌丝发育。洗去多余的血清。

接种S. mutans，然后加入富含蔗糖的培养基并进行培养。S. mutans 分泌葡萄糖基转移酶，该酶可结合至C. albicans的甘露聚糖。

该酶在真菌表面将蔗糖催化生成葡聚糖，使细菌锚定于菌丝上，并促进其增殖和基质形成。

该方法可获得模拟口腔致病过程中微生物协同作用的跨域生物膜。

在37摄氏度有氧条件下，于血琼脂平板上培养S. mutans和C. albicans。

然后将每种生物的单个菌落转移至装有5毫升脑心浸液的试管中，并继续培养18小时。

第二天，将培养物在1,200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。用生理盐水重悬细胞，并将白色念珠菌（C. albicans）和变形链球菌（S. mutans）的OD₅₅₀ 调整至0.5。

然后将S. mutans菌悬液按1:10稀释，以获得等效浓度。用移液器将50 µL无菌唾液溶液加入光学底96孔板的各孔中，用于显微镜观察。

将培养板在37摄氏度下孵育30分钟，然后用100微升无菌生理盐水洗涤培养板3次，并弃去孔内液体。

向每个孔中加入 100 微升 C. albicans 悬液，在 37 摄氏度下孵育 90 分钟，然后用生理盐水洗涤孔三次。

随后，向每个孔中加入 100 µL 热灭活的胎牛血清。将培养板孵育 2 小时，然后用生理盐水洗涤 3 次。

吸出各孔中的液体，但保留20微升的残留液以避免过大的剪切力。向每孔中加入100微升S. mutans菌悬液和150微升含5%蔗糖的BHI培养基。然后将培养板在37°C下孵育24小时或更长时间。

培养较老的生物膜时，需每日更换培养基。在跨域生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤培养板五次。