评估生物膜基质完整性的乙醇抗性检测

取在营养琼脂上培养的致病菌来源的生物膜。

未经处理的生物膜中，细菌在保护性的胞外基质内密集排列。

经抑制剂处理的生物膜中，细胞在稀疏的基质内呈松散聚集状态。

将每个生物膜一分为二，其中一半用缓冲液处理作为对照，另一半用乙醇处理以施加抗菌应激。

在未经处理且暴露于乙醇的生物膜中，致密的基质会降低乙醇的扩散并限制其进入细胞，从而导致细菌杀灭效果减弱。

在经抑制剂处理并暴露于乙醇的生物膜中，稀疏的基质使得乙醇更易渗透，从而导致细菌杀灭作用增强。

离心试管并弃去上清液。加入缓冲液，超声处理以分散细胞。

接种稀释后的菌液并培养，以促进可存活细菌的生长。

计数菌落形成单位（CFUs）；经抑制剂处理并暴露于乙醇的生物膜产生的CFU较少，证实基质完整性对乙醇耐受性至关重要。

取一把干净的剃刀刀片，在模板的辅助下将生物膜菌落切成大小相等的两半。用干净的刮勺小心地挑起其中一半菌落，并转移至含有 500 µL PBS 的 1.5 mL 微型离心管中。

取菌落的另一半，转移至含有500微升50%乙醇的微量离心管中。这些样品将用于评估对消毒剂的抗性。随后，同样取经D-亮氨酸处理的菌落的前半部分，放入磷酸盐缓冲液（PBS）中。

然后，取该菌落的另一半，转移至乙醇中。将含有生物膜半部分的所有试管在室温下孵育10分钟，随后在18,000 × g 条件下离心5分钟。

使用移液器小心吸去上清液。加入 300 微升 PBS，然后使用微探头超声仪在低功率条件下对细胞进行超声处理。再加入 700 微升 PBS，使最终体积为 1 毫升。

接下来，在 PBS 中进行 10⁻⁷ 的系列稀释。取其中一种稀释液 100 µL，接种于 1.5% 琼脂 LB 培养板上。每份样品另取两种稀释液，重复此步骤。

使用玻璃珠涂布接种物，然后在30摄氏度下倒置培养平板过夜。观察平板并计数菌落形成单位（CFU）。计算每毫升的CFU数值后，进一步计算PBS处理组与乙醇处理组中的存活率百分比。