用于形态学分析的细菌生物膜菌落制备

从营养琼脂平板上培养的细菌生物膜菌落开始。

这些生物膜由一种疏水性的胞外基质构成，可保护包埋的细菌免受宿主免疫反应的攻击。

加入固定剂，轻轻旋转培养板，直至生物膜开始漂浮。

密封培养板，并在轻柔振荡条件下孵育，以维持生物膜结构。

移除固定剂，加入缓冲液，并孵育以稳定生物膜结构。

使用巴斯德移液管，轻轻将菌落从琼脂上分离。

加入浓度递增的乙醇以脱水细菌菌落。

将漂浮的菌落转移至经乙醇浸润的滤纸上，并在密闭容器中空气干燥。

将干燥的菌落用导电胶带固定在涂有碳膜的载台上，并用碳胶带进行连接，以防止电子束引起的电荷积累。

接下来，用导电金属层包覆生物膜，以增强成像对比度。

生物膜现已准备好进行电子显微镜的形态学分析。

开始样品固定时，首先为所需数量的生物膜菌落配制足量的新鲜固定液。向每个培养皿中小心加入5毫升固定液，避免将固定液直接滴加到菌落上。菌落将开始从琼脂上脱离并漂浮起来。

用封口膜仔细密封培养板，在室温下于旋转摇床上孵育两小时。将培养板转移至4摄氏度环境中过夜保存。

使用连接真空泵的巴斯德吸管轻轻吸除固定液。

加入10毫升含有100纳摩尔二甲胂酸钠和5毫摩尔氯化钙的缓冲液以洗涤生物膜，并孵育5分钟。用巴氏吸管小心地从琼脂平板上分离生物膜菌落的中心部分。

为使菌落风干，将纤维素滤纸剪成四等份，然后将其中一份浸入100%乙醇中。

小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移到纸片上。将纸片放入铺有干燥滤纸的培养皿中。然后盖上皿盖，置于化学通风橱中过夜干燥。

为了保持生物膜菌落的形态，必须用纤维素纸完全托住漂浮的生物膜。一旦将生物膜置于纸上，便不能再进行调整。

用碳胶带包覆电子显微镜载台，然后使用镊子小心地将生物膜菌落转移至载台上。

将每个菌落通过添加一条细小的碳胶带桥接至样品台后，将样品台置于干燥器中保存24小时，或保存至需要使用时。

此步骤需要稳定而精确的操作，因为此时的生物膜非常脆弱，容易破裂。挑战在于完整固定较大面积的生物膜，且不产生裂纹。

在检查当天，将菌落放入金-钯溅射镀膜仪中。以60度角对样品镀膜两分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转120度。

最后，从上方对样品进行一次三分钟的镀膜。样品现已准备好用于扫描电镜成像。