囊性纤维化患者痰液滤液诱导的细菌生物膜共聚焦成像

将含有贴壁细菌的腔室盖玻片分别置于添加了囊性纤维化患者来源痰液滤液的培养基以及不含滤液的培养基中进行孵育。

痰液滤液含有宿主来源的成分，可刺激细菌信号通路，从而触发基质产生和生物膜形成。

生物膜形成后，弃去含有游离细菌和残留宿主来源成分的培养基。

用缓冲液清洗以去除松散附着的细菌。

加入含有膜通透性和膜不通透性荧光染料的染色混合物，并在避光条件下孵育。

膜通透性染料可穿过完整的细胞膜，对活菌和非活菌均进行标记。相比之下，非通透性染料只能进入受损的细胞膜，从而选择性地标记非活菌。

孵育后，移除染色液，并用缓冲液洗涤以去除过量染料并降低背景荧光。

加入新鲜培养基，并使用共聚焦显微镜采集图像。

利用痰液滤液培养的生物膜表现出增大的厚度，凸显了宿主来源成分在生物膜形成中的作用。

培养后，移除腔室孔中的培养基，并用 300 微升无菌 PBS 轻轻洗涤每个腔室两次。

接下来，为了制备生物膜染色混合液，将活力检测试剂盒中提供的每种染料各取1微升，加入到所需每毫升溶液中，并混匀溶液。

每种生物体所需的染料最佳用量和染色时间需通过实验经验确定。

向玻璃培养腔的每个孔中加入 200 µL 染色混合液。孵育培养腔盖玻片。

孵育后，从培养室中移除染色混合液，并用 300 微升无菌 PBS 洗涤每个孔。

用新鲜培养基替换 PBS。最后，通过共聚焦显微镜进行观察。