利用光敏剂前体进行光激活治疗细菌生物膜

从含有致病菌生物膜的微孔板孔开始，分为四个实验组。

轻轻吸去培养基，并用缓冲液冲洗以去除非贴壁细胞。

向两组中加入含有光敏剂前体的缓冲液，其余两组仅加入缓冲液。

将所有组置于避光条件下孵育，以使前体扩散通过生物膜，进入细菌细胞，并代谢生成在细胞质和膜内积累的光敏剂。

孵育后，将一组经前体处理的样品和一组仅含缓冲液的样品暴露于光照 irradiation。

在前体处理组中，光照激发光敏剂，光敏剂将能量传递给分子氧并产生活性氧（ROS）。

活性氧（ROS）会破坏细胞膜、降解蛋白质并断裂DNA，从而导致细菌细胞死亡。

其余三种条件下均未产生活性氧，因为缺少前体物质或光照，导致生物膜未受影响。

在96孔板中形成生物膜时，首先将一株从-80摄氏度保存条件下解冻的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300临床分离株，接种于3个独立的14毫升圆底试管中，每管含有5毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，在37摄氏度摇床中过夜培养。当菌液达到稳定期后，离心收集菌体，并用PBS重悬菌体沉淀，调整浓度至每毫升2×10⁹个菌落形成单位。将上述菌悬液用添加0.5%葡萄糖的TSB培养基按1:200比例稀释，随后向每个多聚苯乙烯细胞培养处理的96孔微量培养板中，每个实验组每株菌接种3个复孔，每孔加入200微升菌液，在37摄氏度、有氧、不振荡条件下培养24小时。

第二天，用 PBS 轻轻洗涤各孔三次，注意不要破坏生物膜。接着，向相应的实验孔中加入 200 µL 新鲜配制的 ALA，并将培养板置于 25 °C 条件下避光孵育 1 小时。然后，使用发光二极管以 100 mW/cm² 的光强照射培养板 1 小时。