Name: 结合亲脂性染料，原位杂交，免疫组织化学和组织学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学习亲脂性染料注射、原位杂交、免疫组织化学和组织学技术，用于小鼠神经组织的多维度分析。该方法可从单一标本中同时获取基因表达、蛋白质定位与形态学数据，显著提高神经科学研究效率。

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共聚焦图像在爱荷华大学卡弗影像中心获得。本研究由美国小企业创新研究计划（SBIR）基金（MH079805）向 B.F. 提供资助。本项目小鼠繁育的额外支持由美国国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）（5R01DC00559007）向 B.F. 提供。

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

小鼠组织的采集严格遵循爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（ACURF 0804066）制定的指南和规定。

在本视频中，我们展示了一种结合四种技术的方法，通过在同一只动物体内关联数据（图3），以最大化数据采集量和整体一致性。该方法将减少繁育所需数量，从而缩短获得可发表数据所需的时间，同时提升对突变体共定位及关联效应的信息获取。尽管本视频使用小鼠胚胎进行实验，但这些技术同样适用于成年小鼠以及其他动物，如鸡、非洲爪蟾和斑马鱼。当使用其他物种时，蛋白酶K消化步骤可能需要调整。本实验中，我们采用不同荧光的NeuroVue染料，特异性标记最多三种目标神经元群体。这些染料的优势在于可用于突变小鼠，而仅依赖免疫组织化学时可能会因待分析突变的影响导致染色失败或不稳定；此外，这些染料可实现神经元的逆行和顺行标记。 5最近一项研究还将可同时标记的神经元群体数量增加到了六个 2随后，可使用脂溶性染料对相同的目标组织进行示踪分析 原位 杂交用于基因转录分析，随后可通过免疫组织化学分析蛋白质分布。后者可结合详细的组织学分析，以进一步完善表型特征的鉴定。 6这种多因素分析有望通过对同一只动物进行相关性分析，获得新的见解，而这些见解若通过其他方法可能难以实现，或至少需要更复杂的实验方案和小鼠繁育过程。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 杂交：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC DIG 洗涤 + 封闭缓冲液套装</td><td>Roche Group</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>预混 20x SSC 缓冲液</td><td>Roche Group</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K 20mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯 (DEPC)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>抗-地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>RNase A 酶 10mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA 10mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 滤器单元 0.22&amp;mu;m；500ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>滤纸圆片 0.2&amp;mu;m；25mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4，粉剂包装</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;免疫组织化学：&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 染料</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;组织学：&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 包埋介质/DMP-30 试剂盒</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>DPX 封片剂</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>设定为 60&amp;#x00B0;C 的培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;染料示踪：&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>NeuroVue 染料：栗色、红色、翠绿色</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>设定为 36&amp;#x00B0;C 的培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>甘油</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 (4% 和 0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

联合使用疏水性染料， 原位 杂交、免疫组织化学与组织学

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

超越单个基因功能、更深入地研究基因调控网络，需要将多个突变组合于同一个动物体内。对两个或更多基因的此类分析必须辅以 原位 对其他基因进行杂交，或对其蛋白质进行免疫组织化学分析，可在整体安装的发育器官或切片中进行，以详细解析细胞和组织表达的变化。结合多种基因修饰需要使用 cre 或 flipase 系统进行条件性基因删除，以避免胚胎致死。所需的繁育方案会随着突变基因数量的增加而显著提高工作量和成本，最终获得具有全套目标遗传修饰的动物数量极少。为获得这些携带多重突变的珍贵样本所投入的巨大时间和精力，要求必须优化组织处理流程。此外，利用多种技术对单个动物进行研究，有助于将基因删除引起的缺陷与表达谱更紧密地关联起来。我们已开发出一种技术，可对单个动物进行更全面的分析，能够从同一标本中——无论是整体安装的器官还是切片——同时分析多种在组织学上可识别的结构以及基因和蛋白的表达。尽管本技术的有效性已在小鼠中得到验证，但其可广泛应用于多种动物。为此，我们结合了脂溶性染料示踪与整体安装 原位 杂交、免疫组织化学和组织学，以提取尽可能多的数据。

介绍了一种结合多种技术的方法，以最大限度地从小鼠组织中收集数据。

超越单个基因功能的研究，需要将多个突变组合于同一个动物体内，以更深入地解析基因调控网络。这种对……的分析

超越单个基因功能的研究，对基因调控网络进行分析，需要在单个动物体内引入多个突变。在本系统中，我们优化了从单一组织中获取的数据量，以将基因突变与形态学及表达谱特征相关联。首先通过注射脂溶性染料来可视化多个离散的神经元群体，从而实现这一目标。原位双杂交用于可视化基因转录本的空间时间表达模式。免疫组织化学可反映蛋白质表达的特定模式，而组织学切片所增加的维度有助于表型特征的鉴定。结合使用该实验系统，能够对同一标本中经整体封片和切片制备的多种不同组织学可识别结构，以及基因和蛋白质表达进行分析。本文介绍一种结合脂溶性染料示踪与原位双杂交、免疫组织化学及组织学的系统。该技术通过将形态学与基因和蛋白表达相关联，最大限度地从单个样本中获取信息。对于所有组织的解剖和操作，使用蠕动泵和适当尺寸的针头经心脏灌注，在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中含4%多聚甲醛固定动物。由于染料对光敏感，应将其存放在黑暗密闭的容器中；为避免交叉污染，在解剖显微镜下操作时，应为每种染料指定专用的一套器械。确定染料应用位点，以选择性地标记目标神经元群体，而不标记其他无关结构。去除无关组织，以直观确认所选位点并便于染料放置。现在使用显微剪刀将预加载的神经示踪染料滤纸条剪成适当大小的三角形片段。务必切割尽可能小的滤膜片，以避免在插入软组织（如脑组织）时标记到其他结构。使用滤膜三角形的尖端刺入组织以插入滤膜。对于较坚硬的组织，可先做一个切口，以便更顺利地插入D。切勿使用解剖针将滤膜推入组织中。将标本置于含有4%多聚甲醛的密封小瓶中，在36°C避光条件下孵育2至14天，具体时间取决于标本年龄及所需扩散距离。使用配备落射荧光装置的解剖显微镜，确认染料已扩散至目标位置，随后解剖分离出目标组织。用甘油将标本固定于载玻片上，用于共聚焦显微镜成像。成像脂溶性眼睛后，将共聚焦转移样品放入含有无RNA酶PBS的2毫升无RNA酶离心管中，以系统性地洗去甘油。在4°C下通过梯度甲醇系列对样品进行脱水和再水化处理。首先在100%甲醇中孵育至少1小时，然后逐步降至25%甲醇中孵育15分钟。用一倍PBS洗涤三次，每次五分钟。用2微升20毫克/毫升储存液的蛋白酶K加入2毫升新鲜PBS中消化组织。通过观察组织浑浊度由不透明变为几乎透明来监测消化反应。为了终止酶消化反应，将样品在4%多聚甲醛中孵育5分钟。随后用PBS洗涤一次，每次1分钟，再进行三次每次5分钟的洗涤。弃去最后一次PBS洗涤液时需特别注意尽可能彻底去除，作为杂交前的预处理步骤。将样品在1.8毫升杂交液中孵育。在60摄氏度下于翻转仪中孵育1小时，使鲑鱼精子DNA在85摄氏度孵育10分钟以变性，随后置于冰上。向每个样品中加入200微升变性的单链DNA和约100纳克DIG标记的riba探针，在杂交炉中于60摄氏度过夜杂交。在杂交炉中，用2倍SSC溶液在60摄氏度下对样品进行三次洗涤，每次10分钟。重要的是，在ISO温控加热块中，用2倍SSC溶液在70摄氏度下洗涤60分钟，以去除内源性碱性磷酸酶活性。随后用PBS缓冲液洗涤样品5分钟。现在更换 PBS，加入一微升浓度为十毫克每毫升的 RNAs A，在 ISO temp 恒温加热块中 37 摄氏度孵育 60 分钟。弃去 PBS 中的 RNAs A，再用洗涤液洗涤三次，每次 10 分钟。最后，在ISO恒温加热块中于70摄氏度孵育60分钟，以加热并激活任何残留的RNA。最后一步是显色观察核糖探针。将样品在1倍封闭缓冲液中孵育1小时。弃去封闭缓冲液，向每个样本中加入含有1 µL抗沟抗体的2 mL封闭缓冲液。4°C孵育过夜，随后用1×洗涤缓冲液洗涤数次，具体操作如前所述。然后将样本在1×洗涤缓冲液中4°C孵育过夜。用一倍检测缓冲液冲洗样本10分钟，并将样本转移至孔板中。弃去缓冲液，使用BM紫显色，因为BM.Purple对光敏感。当达到理想的信号强度时，用铝箔或盒子覆盖避光。用一倍检测缓冲液在孔中冲洗样本五分钟。使用透射显微镜对样本进行成像，或将样本保存在4%多聚甲醛中，置于4摄氏度环境下。如需去除脂溶性染料，可使用梯度乙醇系列处理组织。然后在5到10分钟内逐步加入PBS以重新水化组织。现在将组织在摇床上于室温下用2.5%正常山羊血清和0.5%Triton X-100封闭1小时，随后在封闭液中稀释一抗，于4°C摇床孵育48小时，再用PBS洗涤3次，每次1小时。再次对样品进行封闭，然后在封闭液中稀释荧光标记的二抗，于4°C摇床孵育12至24小时。从这一步开始，应注意避免样品接触光线，因为二抗对光敏感。再次用 PBS 每次一小时，清洗样品三次。最后通过落射荧光显微镜和共聚焦显微镜成像分析标本。环氧树脂包埋和切片需要将组织固定在含有 2.5% 戊二醛和 1% 多聚甲醛的 0.1 摩尔磷酸缓冲液中，通常在玻璃样品瓶中过夜；随后通过梯度乙醇孵育对组织进行脱水；接着过渡至溶剂，用等体积的无水乙醇与丙烯酸甲酯混合液孵育五分钟，然后用丙烯酸甲酯进行五次、每次十分钟的洗涤；最后在摇床上将样品与树脂渗透液（等体积丙烯酸甲酯与树脂混合）简单孵育过夜。将含有样品的溶液倒入平底包埋模具中，在实验台上静置4至6小时，使丙烯酸氧化物挥发。将样品转移至最终模具中的100%树脂中，浸泡4小时。用树脂包埋样品，并贴上标签。将树脂在60摄氏度下孵育24至48小时，使其聚合。为尽量减少多余的树脂，可根据需要使用剃刀片修整树脂块。在超薄切片机上。使用透射和落射荧光显微镜对样品进行一至两微米的连续切片、贴片和成像。不同波长的脂溶性染料可促进可视化三种不同脑神经的中枢投射。此处将脂溶性染料置于三叉神经、舌咽神经和迷走神经的周围部分。染料扩散孵育后，通过明场显微镜可观察到神经中枢突延伸至脑干。当后脑被解剖并平铺固定时，三条标记神经的中枢突部分可见清晰的标记。在明场显微镜下，共聚焦显微镜可实现特定区域的立体成像，而使用三种不同的染料可评估各神经群体的分布情况。与其他部分相比，此处通过神经视图技术追踪新生小鼠的内耳传入神经。C中的红色显示prox1的双荧光原位杂交信号，以及抗微管蛋白抗体和抗prox1抗体免疫反应性的组合，用于可视化传入神经。此外，通过两微米厚的环氧树脂切片可对耳蜗进行横截面成像。在进行该操作时，重要的是要仔细选择脂溶性染料的放置位置。充分了解神经解剖学知识将有助于此过程，同时需谨慎对待所有对光敏感的步骤。该步骤将减少获得可发表数据所需的繁育工作量和时间，同时提高对突变体中共定位和覆盖效应的信息了解。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

结合亲脂性染料，原位杂交，免疫组织化学和组织学

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+...

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

来源：Jolly, S.，等．在小鼠脑切片中联合使用双重荧光原位杂交与免疫标记检测三个基因的表达．J. Vis. Exp.

在小鼠脑切片中进行双重荧光原位杂交以检测基因表达

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。...

双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本文介绍了一种用于淋巴瘤组织中多种癌症相关抗原同时定位的多重荧光免疫组织化学染色与成像方案。该方案可推广应用于所有组织切片中生物标志物的共定位分析。...

淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

本方案详细阐述了预先包埋免疫电镜技术的各个步骤，重点在于研究视网膜中的突触环路和蛋白质定位。...

通过预包埋免疫电镜技术研究视网膜环路与分子定位

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