结合亲脂性染料，原位杂交，免疫组织化学和组织学
March 17th, 2011
不同的技术组合，以最大限度地从小鼠组织中的数据收集。
超越单个基因功能并分析基因调控网络需要在单个动物中进行多个突变。在这个系统中，我们优化了从单个组织生成的数据量，以将基因突变与形态学和表达谱相关联。这是通过首先注射亲脂性模具来实现的，以可视化几个离散的神经元群。
进行原位两次杂交以可视化基因转录本的时空模式。虽然免疫组织化学反映了蛋白质表达的特定模式，但组织学切片的增加维度有助于表型表征。组合的。该实验系统能够分析几种不同的组织学可识别的结构，以及基因和蛋白质表达，所有这些都来自同一标本中的孔安装和切片制备 Weise 一个结合了亲脂性染料示踪和 C 2 杂交、免疫组织化学和组织学的系统。
该技术最大限度地提高了从单个标本中获得的信息，同时将形态与基因和蛋白质表达相关联 对于所有组织解剖和作。使用带有适当大小的针头的蠕动泵，通过跨心脏灌注将动物固定在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中的 4% paraldehyde 中。由于 DY 对光敏感，因此将它们存放在黑暗的密闭隔间中，为避免交叉污染，请指定一组单独的仪器在解剖显微镜下处理每种染料。
确定染料应用位点，以选择性地标记正在考虑的神经元群，而不是其他外来结构。提取外来组织，以便目视确认所选部位和染料放置的途径。现在用微型剪刀将预装的 neuro view 染料滤光片条剪成大小合适的三角形。
确保切得尽可能小，以避免标记其他结构以直接插入软组织，例如大脑。使用过滤器三角形的一个点插入过滤器以刺穿组织。对于更坚硬的组织，请切开以便更容易插入 D.Do 不要使用解剖针将过滤器推入组织。
将标本放入含有 4% 对甲醛的安全密封小瓶中，并在 36 摄氏度下避光孵育 2 至 14 天，具体取决于年龄和要覆盖的扩散距离。使用带有 epi 荧光的解剖镜，验证染料是否已扩散到所需位置并解剖出感兴趣的组织。将标本固定在带有甘油的载玻片上，以便使用共聚焦显微镜进行成像。
在共聚焦上对亲脂性眼睛进行成像后，将样品转移到 2 mL 不含 RNA 的 eph 管中，用不含 RNA 的 PBS 系统地冲洗掉甘油。在 4 摄氏度下使用分级甲醇系列进行脱水和再水化处理样品。首先在 100% 甲醇中孵育至少一小时，然后降至 25% 甲醇 15 分钟。
在一次 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。每。用 2 微升 20 毫克/毫升的蛋白酶原液 K 在 2 毫升新鲜 PBS 中消化组织。通过组织混浊性从不透明到几乎透明的变化来监测消化反应。
为了停止酶消化，将样品在 4% 对位甲醛中孵育 5 分钟。然后用 PBS 洗涤一次，每次 1 分钟，然后洗涤 3 次，每次 5 分钟。丢弃最终的 PBS 洗涤液，特别注意尽可能多地消除作为预杂交步骤。
在 1.8 mL 杂交中孵育样品。在 60 摄氏度下在逆变器上混合 1 小时，通过在 85 摄氏度下孵育 10 分钟使鲑鱼精子 DNA 变性，然后置于冰上，加入 200 微升变性单链 DNA 和大约 100 纳克 DIG 标记的核糖。探测每个样品并在 60 摄氏度下在杂交炉中杂交过夜。
在杂交炉中，在 60 摄氏度下用 2 倍 SSC 洗涤 3 次 10 分钟，处理样品。重要的是，在 ISO 温度加热块中，在 70 摄氏度下用两倍 SSC 洗涤 60 分钟，去除任何内源性碱性磷酸酶活性。用 PBS 洗涤样品 5 分钟。
现在更换 PBS 并添加 1 微升，每毫升 10 毫克。RNA A 并在 37 摄氏度下在 ISO 温度加热块中孵育 60 分钟。弃去 PBS RNA A，在洗涤液中洗涤 3 次，每次 10 分钟。
最后，通过在 ISO 温度加热块中于 70 摄氏度孵育 60 分钟来加热并激活任何剩余的 RNA。最后一步是可视化 ribo 探针。将样品在 1 次封闭缓冲液中孵育 1 小时。
丢弃封闭缓冲液，向每个样品中加入 2 毫升含有 1 微升抗沟抗体的封闭缓冲液。如图所示，用 1 次洗涤缓冲液孵育过夜洗涤数次。然后将样品在 1 次洗涤缓冲液中孵育过夜。
用 1 次检测缓冲液冲洗样品 10 分钟，然后将样品转移到孔板中。丢弃缓冲液并用 BM 紫色显色，因为 BM。紫色对光敏感。获得所需的信号强度时，用箔或盒子覆盖。
在孔中用 1 次检测缓冲液冲洗样品 5 分钟。用透射显微镜对样品进行成像或将它们储存在 4 摄氏度的 4% 对甲醛中。如果需要，用分级乙醇系列去除组织中的亲脂性染料。
然后在 5 到 10 分钟内逐渐添加 PBS 来重新水化组织。现在，在室温下用 2.5% 正常山羊血清和 0.5% Triton X 100 在摇床上封闭组织 1 小时，与在封闭溶液中稀释的一抗在 4 摄氏度下在摇床上孵育 48 小时，用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 小时再次封闭样品，然后与在封闭溶液中稀释的荧光偶联二抗在 4 摄氏度下孵育 12 至 24 小时在摇床上。从这时起，应注意阻挡来自样品的光线，因为二抗对光敏感。
同样，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 1 小时。最后，通过使用落射荧光和共聚焦显微镜成像来分析标本。环氧树脂包埋和切片需要将组织固定在 2.5% 戊二醛、1% PFA 的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中，通常在玻璃样品瓶中过夜，现在用分级乙醇孵育组织，以过渡到溶剂，将 absolu 乙醇与环氧丙烷一对一孵育 5 分钟，然后在环氧丙烷中洗涤 5 次，每次 10 分钟，仅用树脂浸润样品，在一对一环氧丙烷中简单孵育，以树脂在摇床上过夜。
将溶液和样品倒入平坦的包埋模具中，在柜台上放置 4 到 6 小时以蒸发环氧丙烷。将样品转移到 100% 树脂中，在最终模具中放置 4 小时。将样品包埋在树脂中并贴上标签。
在60 摄氏度下孵育 24 至 48 小时，让树脂聚合。为了尽量减少外来树脂，请根据需要用剃须刀片雕刻树脂块。在超薄切片机上。
使用透射和落射荧光显微镜切割 1 到 2 微米的连续切片、安装和成像样品。不同波长的亲脂性染料可以促进三种不同颅神经的中央投影的可视化。在这里，亲脂性模具被放置在三叉神经、舌咽神经和迷走神经的外围部分。
孵育染料扩散后，通过明场显微镜观察脑干的神经中枢过程。当后脑被解剖并平装时，三个标记神经的中枢突的一些标记很明显。在明场显微镜下，共聚焦显微镜允许在特定照明的情况下保持维度，并且使用三种不同的染料可以评估每个群体的分布。
相对于其他人，在这里，新生小鼠的内耳传入是通过神经视图追踪的。C 中的红色 prox 1 的两个杂交，以及抗微管蛋白和抗 prox 的免疫反应性的组合。一个用于可视化传入。
此外，2 微米厚的环氧树脂切片将耳蜗成像为横截面动作。尝试此程序时，请务必仔细选择亲脂性眼的位置。对神经解剖学的良好理解将有助于在此过程中也要小心所有照片敏感步骤。
该程序将减少繁殖量和获得可发布数据所需的时间，同时改善有关突变体中共定位和 cove 效应的信息。
概述
本文介绍了一系列技术的组合，以优化从小鼠组织中收集数据。这些方法允许将遗传突变与形态和表达谱相关联。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 组织学
背景
- 分析基因调控网络需要单个动物中的多个突变。
- 可视化离散的神经元群体对于理解基因功能至关重要。
- 结合各种技术增强了从单个标本中收集数据的能力。
- 组织学切片有助于表型表征。
研究目的
- 从单个标本中最大化获得信息。
- 将形态与基因和蛋白质表达相关联。
- 开发一个集成多种可视化技术的系统。
所用方法
- 注射亲脂染料以可视化神经元群体。
- 原位杂交以分析基因转录模式。
- 免疫组化用于蛋白质表达分析。
- 组织学切片用于详细的表型表征。
主要结果
- 成功可视化单个标本中的多个神经元群体。
- 遗传突变与形态数据的相关性。
- 增强了对基因和蛋白质表达模式的理解。
- 证明了结合技术的有效性。
结论
- 该研究为小鼠组织的多方面分析提供了一个稳健的框架。
- 结合技术允许全面的数据收集。
- 这种方法可以应用于神经科学领域的各种研究问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating lipophilic dye tracing, in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology enables comprehensive analysis of gene regulatory networks in complex animal models. This approach maximizes data yield from rare multi-mutant specimens, supporting high-confidence target validation and mechanistic de-risking at critical discovery inflection points. The method is highly relevant for biopharma teams seeking to correlate genetic perturbations with cellular and tissue-level phenotypes in translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of genetic mutations with morphological and molecular expression profiles.
- Supports functional target validation by integrating gene, protein, and tissue-level data from single specimens.
- Facilitates mechanistic de-risking in complex gene regulatory network studies.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multi-modal biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes tissue processing and imaging for reproducible, quantitative outputs.
- Enables multiplexed analysis of gene and protein expression in the same tissue context.
- Supports reliable evaluation of compound effects in genetically engineered models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic and molecular readouts with disease-relevant systems in animal models.
- Provides continuity from genetic manipulation through preclinical phenotype validation.
- Reduces risk of late-stage biological failure by integrating multi-level data.
- Enables translational biomarker discovery through comprehensive tissue analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical research by extracting maximal data from rare, multi-mutant animal models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by correlating gene deletions with phenotypic outcomes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging and molecular data for assay development.
- Analytics: Provides multi-modal measurements enabling robust comparison of genetic and phenotypic conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from genetic manipulation to preclinical validation in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-technique tissue analysis across diverse animal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes multi-modal tissue analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing data from limited specimens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, molecular labeling, and advanced microscopy.
- Demands access to confocal and transmission microscopy, as well as specialized reagents for dye tracing and immunolabeling.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to avoid cross-contamination and ensure reproducibility.
- Adaptable to various animal models but may require protocol optimization for different tissue types.
- Photo-sensitivity and dye handling steps require careful operational controls as highlighted in the protocol.
