基于荧光的巨噬细胞受体与细菌抗原相互作用研究方法

从聚合物包被的盖玻片上固定的红色荧光标记的M. tuberculosis抗原开始。

加入封闭缓冲液以封闭非特异性结合位点。洗涤以去除过量的封闭剂。

加入从人巨噬细胞中提取的总蛋白，其中包含目标细胞表面受体。孵育。

巨噬细胞受体与固定的细菌抗原结合。

加入交联剂以稳定受体-抗原复合物，随后加入淬灭剂以中和未反应的交联剂。

洗涤并加入第二种交联剂以增强复合物的稳定性。

再次洗涤，然后取下盖玻片并将其倒置于一滴一抗溶液上。

抗体结合至目标巨噬细胞受体。

将盖玻片清洗后倒置在绿色荧光素标记的二抗溶液上，该二抗可与一抗结合。

清洗并封固盖玻片。

在荧光显微镜下观察样品。红色与绿色信号的共定位可证实巨噬细胞受体与细菌抗原之间的相互作用。

使用圆头手术镊子，将12毫米圆形盖玻片放入24孔培养板的孔中。

将盖玻片与Mycobacterium tuberculosis 罗丹明抗原在37摄氏度下孵育1小时。孵育后，加入100微升用300微升PBS稀释的蛋白提取物，在室温下振荡孵育2小时。用石蜡膜包裹培养板的盖子。

在覆盖有石蜡膜的盖子上加入一滴60 µL已预先滴定的抗SLAMF1一抗。使用弯头精细手术镊子和针头小心地从板上取下盖玻片。在与一抗和二抗溶液孵育后，去除多余的液体，并将盖玻片置于载玻片上一滴封片液中。将载玻片置于荧光显微镜下，使用适当的滤光片观察细胞。