高通量细胞内成像 布鲁氏菌 abortus 宿主上皮细胞感染

从上皮细胞开始实验，这些细胞中干扰素衔接蛋白（干扰素适配器蛋白）的表达已被降低，该蛋白是先天免疫的关键介质，其表达减少使细胞更易受到Brucella感染。

用含有表达绿色荧光蛋白的布鲁氏菌（Brucella abortus）的感染培养基替换原有培养基，布鲁氏菌为一种兼性胞内病原体，其浓度按实验需求设定。

离心培养板以促进细菌与宿主细胞的接触，然后孵育以使细菌内化。

用含有血清的培养基洗涤细胞，并使用抗生素处理以清除细胞外细菌。

继续孵育以使 布鲁氏菌 在细胞内增殖。

用缓冲液洗涤细胞，并用多聚甲醛固定，以保存细胞内结构。

洗去多余的固定剂。然后加入含有去污剂的缓冲液以通透细胞。

洗去残留的洗涤剂，然后加入 DAPI 染色细胞核，再进行最后一次洗涤。

利用自动显微镜，对宿主上皮细胞中布鲁氏菌（Brucella）感染进行高通量成像。

使用自动酶标洗板机，将转染培养基更换为 50 微升感染培养基。在生物安全柜内，将板转移至离心机吊篮中，在 4 摄氏度条件下以 400 × g 离心 20 分钟。

然后，用封口膜密封培养板，置于预热的铝板上，在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育4小时。自动化板式洗板机孵育后，使用含10%胎牛血清（FCS）并添加100微克/毫升庆大霉素（GM）的DMEM培养基洗涤细胞，以灭活胞外细菌。随后，用封口膜重新密封培养板，放回孵育箱内预热的铝板上，继续孵育40小时，以进行终点检测。

固定细胞时，首先用 PBS 清洗孔板。然后将 PBS 更换为 50 微升含 3.7% 多聚甲醛的 0.2 摩尔 HEPES 溶液（pH 7.4），并在室温下孵育细胞 20 分钟。

孵育后，使用 50 微升 PBS 更换固定液。使用自动板式洗涤器对样品进行染色时，首先加入 50 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS，作用 10 分钟，以通透细胞。

用 PBS 洗涤细胞三次后，加入 50 µL 含 1 µg/mL DAPI 的 PBS，室温孵育 30 分钟。然后用 PBS 洗涤细胞三次，并避光保护。将培养板转移至自动显微镜下观察。