高通量细胞内成像 布鲁氏菌 abortus 宿主上皮细胞感染
0 次观看 • 3:43 分钟 • March 31st, 2026
从上皮细胞开始实验，这些细胞中干扰素衔接蛋白（干扰素适配器蛋白）的表达已被降低，该蛋白是先天免疫的关键介质，其表达减少使细胞更易受到Brucella感染。
用含有表达绿色荧光蛋白的布鲁氏菌（Brucella abortus）的感染培养基替换原有培养基，布鲁氏菌为一种兼性胞内病原体，其浓度按实验需求设定。
离心培养板以促进细菌与宿主细胞的接触，然后孵育以使细菌内化。
用含有血清的培养基洗涤细胞，并使用抗生素处理以清除细胞外细菌。
继续孵育以使 布鲁氏菌 在细胞内增殖。
用缓冲液洗涤细胞，并用多聚甲醛固定，以保存细胞内结构。
洗去多余的固定剂。然后加入含有去污剂的缓冲液以通透细胞。
洗去残留的洗涤剂，然后加入 DAPI 染色细胞核，再进行最后一次洗涤。
利用自动显微镜，对宿主上皮细胞中布鲁氏菌（Brucella）感染进行高通量成像。
使用自动酶标洗板机，将转染培养基更换为 50 微升感染培养基。在生物安全柜内，将板转移至离心机吊篮中，在 4 摄氏度条件下以 400 × g 离心 20 分钟。
然后，用封口膜密封培养板，置于预热的铝板上，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育4小时。自动化板式洗板机孵育后，使用含10%胎牛血清（FCS）并添加100微克/毫升庆大霉素（GM）的DMEM培养基洗涤细胞，以灭活胞外细菌。随后，用封口膜重新密封培养板，放回孵育箱内预热的铝板上，继续孵育40小时，以进行终点检测。
固定细胞时，首先用 PBS 清洗孔板。然后将 PBS 更换为 50 微升含 3.7% 多聚甲醛的 0.2 摩尔 HEPES 溶液（pH 7.4），并在室温下孵育细胞 20 分钟。
孵育后，使用 50 微升 PBS 更换固定液。使用自动板式洗涤器对样品进行染色时，首先加入 50 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS，作用 10 分钟，以通透细胞。
用 PBS 洗涤细胞三次后，加入 50 µL 含 1 µg/mL DAPI 的 PBS，室温孵育 30 分钟。然后用 PBS 洗涤细胞三次，并避光保护。将培养板转移至自动显微镜下观察。
概述
本方案展示了一种高通量成像宿主上皮细胞内布鲁氏菌（Brucella abortus）感染的方法。该方法可使研究人员可视化并分析感染过程，有助于深入理解布鲁氏菌的致病机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 病原体-宿主相互作用
- 细胞生物学
背景
- 布鲁氏菌（Brucella abortus）是一种兼性胞内病原体。
- 了解其感染机制对于开发治疗策略至关重要。
- 高通量成像技术可促进对感染动态的大规模研究。
- 通过降低宿主先天免疫因子的水平，可调控宿主细胞的易感性。
研究目的
- 观察牛布鲁氏菌（Brucella abortus）的细胞内感染过程。
- 评估宿主细胞因素对感染易感性的影响。
- 提供一种研究细菌致病机制的可靠方法。
使用的方法
- 用表达GFP的牛布鲁菌感染上皮细胞。
- 使用抗生素清除胞外细菌。
- 利用自动化显微镜进行高通量成像。
- 固定细胞并染色以可视化细胞核。
主要结果
- 本方案演示了制备和成像感染细胞的步骤。
- 概述了为获得最佳结果而使用的特定试剂和条件。
- 高通量成像可实现对多个样本的同步分析。
- 结果可为布氏杆菌（Brucella abortus）的细胞内行为提供见解。
结论
- 该方法可实现对布鲁氏菌在宿主细胞内感染过程的详细观察。
- 可用于研究不同处理对感染动态的影响。
- 该方法可能有助于开发新的治疗干预手段。
常见问题
行业重要性概述
该高通量成像方案可系统研究细胞内细菌感染模型中的宿主-病原体相互作用。通过在特定基因扰动条件下定量分析上皮细胞中布鲁氏菌（Brucella abortus）的复制情况，本方法可支持抗菌药物研发项目中的靶点验证和机制层面的风险评估。该检测体系为宿主导向治疗策略的优先排序以及基于信号通路的先导化合物筛选提供了可靠的预测依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将细胞质DNA感应通路与细胞内细菌复制表型相联系，验证治疗假设。
- 操作价值：通过siRNA介导的敲低天然免疫介质（如STING），实现功能靶点的验证。
- 预测价值：在可控的宿主因子调控条件下量化感染动态，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为后续的化合物或遗传筛选实验制备经过验证的上皮细胞体系。
- 操作价值：通过自动化显微成像和定量的GFP表达病原体追踪，实现感染读数的标准化。
- 可扩展性价值：支持在384孔板体系中重复使用该平台，用于高通量宿主因子筛选。
转化与临床前研究
- 转化价值：通过模拟布鲁氏菌对上皮细胞的感染，保持疾病相关性，该过程是人畜共患致病机制中的关键步骤。
- 临床前连续性：将早期发现的机制与在生理相关宿主细胞环境中的验证相连接。
- 风险调整决策：通过揭示对胞内存活至关重要的宿主依赖因素，为推进研究的标准提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导物发现，再到临床前机制确证的整个发现流程，尤其适用于胞内病原体研究项目。
- 发现生物学：支持对影响病原体侵入和复制的宿主因素进行假设验证。
- 筛选：通过标准化的感染、抗生素筛选和固定流程，实现检测就绪。
- 分析：通过GFP信号与细胞核共染色，对单个细胞进行定量分析，生成细胞内病原体负荷的测量结果。
- 转化研究：将先天免疫通路的调控与感染结局相关联，支持基于生物标志物的机制验证。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，适用于其他携带荧光报告基因的胞内细菌或病毒。
运营与企业影响
- 科学价值：通过分离特定的先天免疫贡献，减少宿主-病原体相互作用中的机制模糊性。
- 操作价值：通过自动化液体处理、标准化孵育和固定终点成像，确保实验可重复性。
- 战略价值：在靶点验证早期提供定量的感染表型，从而优化“进行/不进行”的决策。
- 项目组合影响：基于基因依赖性数据，实现对靶向宿主的抗感染药物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、转染以及在BSL-2条件下处理胞内病原体的专业技术。
- 依赖于能够以384孔板格式获取GFP和DAPI信号的自动化显微镜设备。
- 需要跨团队对感染时间、抗生素筛选和固定方案进行标准化。
- 若应用于原代细胞或分化的上皮模型，可能需要优化感染效率和毒性对照条件。
- 实际限制包括对荧光标记病原体菌株的依赖性，以及不同孔间转染效率可能存在的变异性。
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最后更新：29 八月 2026