Name: 骨骼肌的线粒体分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习从大鼠骨骼肌中分离线粒体并测量其呼吸功能的方法。该技术通过离心和匀浆实现，可用于评估不同呼吸状态下的氧气消耗，为研究肌肉代谢和线粒体功能提供重要工具。

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本工作获得了美国国家眼科研究所（R01 EY12998）向 F.H. Andrade 提供的资助。

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>开启离心机 5804R 并设置温度为 4°C。开启 Isotemp 3006D 水浴锅并设置温度为 37°C。</li>
	<li>在肌肉分离前，配制以下溶液：
	<ul>
		<li>PBS：将磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于蒸馏水中（每升水加入 5 片），充分混匀。</li>
		<li>含 10 mM EDTA 的 PBS：取 2 ml 500 mM EDTA 加入 98 ml PBS 中，配制成 100 ml 溶液。</li>
		<li>8X 线粒体缓冲液：加入 10.28 g 蔗糖，终浓度为 0.6 M；400 mg 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA），终浓度为 0.8%；2.08 g HEPES，终浓度为 160 mM；用蒸馏水定容至 50 ml，并调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>分离缓冲液 1（IB1）：加入 200 μl 500 mM EDTA（终浓度为 10 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>分离缓冲液 2（IB2）：加入 60 μl 500 mM EGTA（终浓度为 3 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>实验缓冲液（EB）：加入 100 μl 500 mM MgCl2（终浓度为 5 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、25 μl 2.5 mM KH2PO4（终浓度为 6.25 μM）、2 μl 100 mM EGTA（终浓度为 20 μM）、1.25 ml 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. 肌肉分离
<ol>
	<li>在冰桶中放置三个 10 ml 烧杯、Potter-Elvehjem 组织研磨器以及所有其他必需的仪器/耗材，并置于冰上。整个实验过程中，所有物品必须始终保持冰冷却状态。</li>
	<li>将 IB1 和 IB2 置于冰桶中，EB 则置于温水浴中备用。</li>
	<li>在三个 10 ml 烧杯中应分别加入以下溶液：
	<ul>
		<li>烧杯 1：10 ml PBS</li>
		<li>烧杯 2：10 ml PBS/EDTA</li>
		<li>烧杯 3：3 ml IB1</li>
	</ul>
	</li>
	<li>按照当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法人道处死一只大鼠。</li>
	<li>迅速分离 250–500 mg 骨骼肌组织，先在烧杯 1 中冲洗，然后转移至烧杯 2 中。</li>
</ol>
3. 匀浆/线粒体分离
<ol>
	<li>将肌肉转移至3号烧杯，用剪刀将肌肉精细剪碎。</li>
	<li>将溶液转移至Potter-Elvehjem匀浆器中，使用电动研杵（钻床亦可）匀浆10次，全程保持离心管置于冰上。</li>
	<li>将匀浆液转移至预冷的2 ml 微量离心管中，在4°C下以700 g 离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>将上清液在4°C下以10,500 g 离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的预冷微量离心管中，标记为SN1（上清液1号）及肌肉类型。</li>
	<li>用500 μl IB2重悬沉淀。</li>
	<li>在4°C下以10,500 g 离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的预冷微量离心管中，标记为SN2（上清液2号）及肌肉类型。</li>
	<li>用100 μl IB2悬浮最终的线粒体沉淀。</li>
	<li>将最终的线粒体悬液在小型离心机中短暂离心数秒。若有沉淀，将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>采用Bradford法测定蛋白浓度8。</li>
</ol>
4. 电极校准
注意：在线粒体分离过程中完成电极校准。
<ol>
	<li>向250 ml锥形瓶中加入100 ml蒸馏水。剧烈搅拌20分钟，使水与大气气体达到平衡。</li>
	<li>向氧电极中加入几滴50% KCl溶液。</li>
	<li>将一小片蓝色Rizla卷烟纸置于电极顶部。</li>
	<li>将一片PTFE膜置于卷烟纸上。</li>
	<li>使用环形安装器装入内环，然后将外环放入电极的凹槽中。</li>
	<li>连接电极并组装其余设备：较大的塑料环底座、线粒体室和水管。</li>
	<li>打开氧测定仪设备并启动氧测定仪软件。</li>
	<li>将已平衡的水加入线粒体室中。</li>
	<li>加入搅拌子，并将转速调至60。</li>
	<li>开始一项新实验。</li>
	<li>点击“校准”，然后选择1号箱的液相校准。将温度更改为37°C，点击“确定”两次。</li>
	<li>当“Override”变为“OK”时，点击该按钮并打开氮气罐。</li>
	<li>将连接氮气罐的导管插入反应室，建立零氧环境。当状态从“Override”切换后，点击“OK”。</li>
	<li>吸去水，向线粒体室中加入500 μl EB缓冲液。</li>
	<li>用推杆密封反应室。</li>
	<li>若使用多个测定箱，请重复步骤11至15，完成2号箱的校准。</li>
</ol>
5. 线粒体呼吸
<ol>
	<li>启动新实验，运行约1分钟以稳定信号。</li>
	<li>向每个腔室加入足量的线粒体悬液（步骤3.11），使终浓度为150 μg，标记事件，并继续运行1分钟。</li>
	<li>加入10 μl预热的250 mM/125 mM谷氨酸/苹果酸溶液，使终浓度为5 mM/2.5 mM。标记并运行1分钟。此阶段定义为状态2（State 2）。</li>
	<li>加入7.5 μl的10 mM ADP溶液，使终浓度为150 μM，标记后运行30秒。此阶段定义为状态3（State 3）。</li>
	<li>再次加入7.5 μl的10 mM ADP溶液，标记后运行1.5分钟。</li>
	<li>加入0.5 μl预冷的10 mM寡霉素（oligomycin）溶液，使终浓度为1 μM，标记后运行3分钟。此阶段定义为状态4（State 4）。</li>
	<li>加入1 μl预冷的0.1 mM FCCP溶液，使终浓度为0.2 μM，标记后运行3分钟。此阶段定义为状态5（State 5）。</li>
	<li>实验结束后，停止运行并保存数据。</li>
	<li>使用Oxygraph软件获取呼吸速率。</li>
	<li>输入归一化因子：若加入的线粒体蛋白量为150 μg，则归一化因子为0.15。</li>
	<li>计算不同呼吸状态下的归一化呼吸速率。</li>
	<li>通过将状态3（State 3）除以状态4（State 4）计算呼吸控制比（Respiratory Control Ratio, RCR）。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="线粒体呼吸图；nmol O2/ml 与时间的关系；谷氨酸/苹果酸、ADP、寡霉素、FCCP。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 显示骨骼肌线粒体耗氧量的代表性记录曲线。在电极信号稳定后，将线粒体样品加入氧电极室。加入谷氨酸和苹果酸后启动状态 2 呼吸。加入 ADP 后耗氧量增加，定义为状态 3 呼吸。加入寡霉素以抑制 ATP 合酶，获得状态 4 呼吸。最后加入 FCCP 以解偶联线粒体呼吸（状态 5）。表 1 显示了状态 2、3、4 和 5 的代表性耗氧速率。每次实验均计算呼吸控制比（RCR）。RCR ≥4 被认为是线粒体制备物具有活性的证据。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>状态</td>
			<td>标准化速率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>状态 2</td>
			<td>34.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>状态 3</td>
			<td>153.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>状态 4</td>
			<td>16.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>状态 5</td>
			<td>143.70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCR</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 线粒体呼吸速率。 来自骨骼肌线粒体的代表性耗氧速率。数值已根据加入呼吸室的线粒体量进行归一化处理。呼吸控制比（RCR）通过将状态3除以状态4计算得出。RCR≥4 表示线粒体制备物具有活性。

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

我们提供一种从骨骼肌中分离有活性线粒体的方案。如果产量较低，可通过将分离的肌肉组织在冰上用5 ml PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液孵育30分钟来优化方案。为确保胰蛋白酶对肌肉组织的完全消化，肌肉必须充分剪碎。30分钟孵育后，必须将PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液完全替换为3 ml线粒体分离缓冲液1（IB1）。此外，在呼吸测定实验中，胰蛋白酶的使用可能会干扰某些线粒体底物。但在本方案中，所使用的所有底物在采用胰蛋白酶处理时均能获得良好的线粒体制备结果。
对于小鼠骨骼肌，最好合并两条后肢的腓肠肌，或使用整块膈肌。对于大鼠骨骼肌，取一小段腓肠肌或膈肌即可。肌肉组织过多会增加分离操作的难度，并导致得率降低。若需分离眼外肌等非常小的肌肉，则必须合并来自多只动物的肌肉组织，以获得足够的肌肉质量。
本实验方案涉及两种不同的上清液：SN1 和 SN2。这些上清液是差速离心的产物，含有非线粒体蛋白。可将这些上清液以及最终线粒体沉淀中的蛋白质用于 Western 印迹，以验证线粒体制剂的纯度。使用线粒...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 混合</td><td>本地气体供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;#8242;二磷酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>蓝色Rizla卷烟纸</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 蛋白质测定</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>当地气体供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>游离脂肪酸-牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>雄性Sprague Dawley大鼠</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500克</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>氧电极圆盘</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>氧电极</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 软件</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>波特-埃尔维耶姆匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（0.0125 mm） &amp;#215; 25毫米膜</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 台式钻床</td><td>五金店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

从骨骼肌中分离线粒体

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

线粒体是控制细胞生死的细胞器，参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，并调控多种信号级联通路2,3。过去和当前的研究人员已从大鼠和小鼠的肝脏、脑和心脏等组织中分离出线粒体4,5。近年来，许多研究人员致力于研究骨骼肌中的线粒体功能。
本文介绍了一种我们已成功用于从骨骼肌中分离线粒体的方法6。该实验流程要求所有缓冲液和试剂均需新鲜配制，并需要约250–500 mg的骨骼肌组织。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌、膈肌以及大鼠眼外肌中分离得到的线粒体。线粒体蛋白浓度采用Bradford法测定。在制备过程中，必须将线粒体样品保持在冰上低温环境，并在较短时间内（约1小时）完成功能检测。线粒体呼吸作用在37°C条件下使用带有克拉克型氧电极的极谱法（Oxygraph系统）进行测定7。氧电极的校准是本方案中的关键步骤，必须每天进行。将分离得到的线粒体（150 μg）加入0.5 ml实验缓冲液（EB）中。加入谷氨酸（5 mM）和苹果酸（2.5 mM）启动状态2呼吸；随后加入二磷酸腺苷（ADP）（150 μM）以启动状态3呼吸；使用寡霉素（1 μM）——一种ATP合酶抑制剂——来评估状态4呼吸；最后加入羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP，0.2 μM）以测定状态5，即解偶联呼吸6。每次实验后计算呼吸控制比（RCR），即状态3与状态4的比值。RCR ≥4 被认为是线粒体制备具有活性的可靠指标。
综上所述，我们介绍了一种从骨骼肌中分离具有活性的线粒体的方法，该方法可用于生化研究（如酶活性、免疫检测、蛋白质组学）和功能研究（线粒体呼吸）。

本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al. (2007)。线粒体分离过程约需2小时，线粒体呼吸测定可在约1小时内完成。

线粒体是控制细胞生死的细胞器。它们参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，并……

本实验的总体目标是分离线粒体并进行线粒体呼吸测定。首先从喷雾dly大鼠中分离骨骼肌，然后将肌肉组织匀浆，并通过离心法分离线粒体。然后使用Bradford法测定蛋白质浓度。最后，通过多通道生理记录仪测量线粒体呼吸。最终可获得结果显示不同线粒体呼吸状态下的耗氧量。该方法有助于解答骨骼肌研究领域中的关键问题，例如不同干预措施对线粒体功能的影响。尽管该方法可用于研究骨骼肌代谢，也可应用于其他器官，如肝脏、脑、肾脏或几乎任何组织。在开始实验前，为分离骨骼肌，请准备以下溶液：磷酸盐缓冲液（P-B-S）、含10毫摩尔EDTA的P-B-S、线粒体分离缓冲液一（或IB一）、线粒体分离缓冲液二（或IB二）以及实验缓冲液（或eb）。请参阅随附的书面实验方案以获取操作说明。接下来，打开离心机并将其温度设置为 4 摄氏度。打开水浴锅并将温度设置为 37 摄氏度。在一个干净的容器中，将三个 10 毫升烧杯、玻璃匀浆器、玻璃组织研磨器、小型手术剪以及 10 个微量离心管置于冰上。整个实验过程中，所有物品必须始终保持冰上低温。将 IB 1 和 IB 2 置于冰上，EB 则放入温水浴中。然后将以下溶液加入置于冰上的三个烧杯中：烧杯一，10 毫升 PBS；烧杯二，10 毫升 PBS-EDTA；烧杯三，3 毫升 ib. 一。按照当地机构动物护理与使用委员会批准的程序处死一只大鼠。接下来用镊子和梅奥剪刀迅速分离250至500毫克骨骼肌组织。在烧杯一中冲洗，然后转移至烧杯二，以匀浆化肌肉组织。首先将其转移至烧杯三，最后用剪刀剪碎。将溶液转移至Potter-Elvehjem匀浆器中，使用电动研杵在冰上匀浆肌肉组织10次，全程保持离心管处于冰上。接着，将匀浆液转移至预冷的2毫升微量离心管中，在4°C条件下以700 × g离心10分钟。将上清液（S）转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀物。在4 °C条件下，将S上清液以10,500 ×g离心10分钟，将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN1和肌肉类型Reese。将沉淀重悬于500 µL的IB2中，然后在4 °C条件下以10,500 ×g离心10分钟。将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN2和肌肉类型。将最终的线粒体沉淀重悬于 100 微升 IB 2 中。在微型离心机中短暂离心数秒。若有沉淀，将上清液转移至新的预装微量离心管中，并弃去沉淀。氧电极的校准是本实验方案中的关键步骤，必须每天进行。在分离线粒体的过程中可完成电极的校准。首先，将 100 毫升蒸馏水加入 250 毫升锥形瓶中，剧烈搅拌 20 分钟。为使水与大气气体达到平衡，用几滴 50% 氯化钾覆盖 GRAT 电极。接下来，将一小片蓝色Rizla卷烟纸放在电极上方，然后在其上放置一片PTFE膜。使用环状涂药器安装内环，然后将外环放入电极槽中。连接电极，并组装较大的塑料环形底座、线粒体室和水管。打开 GRAT 箱并启动 GRAS 软件。将平衡后的水加入线粒体室中。然后加入搅拌子以启动搅拌。单击硬件。然后以一定速度搅拌。将速度调节至60并点击开始。接下来，启动一项新实验。单击校准，然后选择液相校准。对于一号箱，将温度更改为37摄氏度，然后单击两次“确定”。当“覆盖”变为“确定”时，单击它并打开氮气罐。将连接至氮气罐的探针插入腔室，并建立零氧环境。当系统从“覆盖”状态切换后，点击“确定”。吸除水相，向线粒体腔室中加入 500 µL EB 溶液。用活塞密封腔室。如果使用多个盒子，请对每个盒子从校准步骤开始重复操作。启动新实验并运行约一分钟。为稳定信号，向每个腔室中加入适量的线粒体悬液，使蛋白含量达到150微克。标记该事件并继续运行。一分钟后，加入10微升预热的250毫摩尔谷氨酸和125毫摩尔苹果酸，使终浓度为5毫摩尔谷氨酸和2.5毫摩尔苹果酸，标记该事件，继续运行一分钟。此步骤定义为状态二。接下来，加入7.5 µL的10 mM dATP，使其终浓度为150 µM。然后标记并运行30秒。此定义为状态三。加入另外 7.5 µL 的 10 mmol/L ADP，运行 1.5 分钟。加入 0.5 µL 的冷 10 mmol/L 寡霉素，终浓度为 1 µmol/L，运行 3 分钟。此定义为状态四。加入一微升冰冷的、0.1毫摩尔的FCCP，使终浓度达到0.2微摩尔标记点，室温下振荡反应三分钟。此定义为状态五。实验结束后，终止实验并保存数据。使用筏式软件获取呼吸速率，并输入归一化因子。若加入150微克线粒体蛋白，则归一化因子为0.15。计算不同呼吸状态下的归一化呼吸速率。通过将三态呼吸速率除以四态呼吸速率，计算呼吸控制比（RCR）。该图展示了骨骼肌线粒体耗氧量的代表性记录。在电极信号稳定后，将线粒体样品加入 GRAT 反应室。状态二呼吸通过添加谷氨酸和苹果酸启动。加入DP后，氧气消耗增加，定义为状态三呼吸。通过添加寡霉素抑制ATP合酶，从而获得状态四呼吸。最后，加入FCCP以解偶联线粒体呼吸。该图显示了状态2、3、4和5的代表性耗氧速率。每次实验均计算呼吸控制比（RCR）。RCR 大于 4 被视为线粒体制备物具有活性的证据。在进行该操作时，必须始终将线粒体样品置于冰上。操作完成后，按此步骤进行后续处理。还可以进行其他方法，如蛋白质印迹（Western blots），以回答有关线粒体蛋白质含量等其他问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何从骨骼肌中分离线粒体以及如何检测线粒体呼吸功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

骨骼肌的线粒体分离

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。...

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。...

通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

线粒体是骨骼肌中具有高度表型可塑性的关键代谢细胞器。细胞质蛋白的输入是细胞器生物发生的关键途径，对线粒网状结构的扩展和线粒体功能的维持至关重要。因此，蛋白质输入可作为细胞健康状况的指标。...

骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

本方案描述了一种在样品量有限的情况下分析呼吸链超级复合物的技术。...

从小型组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

学习从大鼠骨骼肌中分离线粒体并测量其呼吸功能的方法。该技术通过离心和匀浆实现，可用于评估不同呼吸状态下的氧气消耗，为研究肌肉代谢和线粒体功能提供重要工具。

从骨骼肌中分离线粒体

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