骨骼肌的线粒体分离
March 30th, 2011
这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano等。（2007年）。线粒体的分离过程中需要约2小时。线粒体呼吸在大约1个小时就可以完成。
该程序的总体目标是分离线粒体并进行线粒体呼吸。这是通过首先从喷雾大鼠中分离骨骼肌来实现的。接下来，将肌肉匀浆并通过离心分离线粒体。
然后使用 Bradford 测定法测定蛋白质浓度。最后，通过测谎仪测量线粒体呼吸。最终，可以获得显示不同线粒体呼吸状态的耗氧量的结果。
这种方法可以帮助回答骨骼肌领域的关键问题，例如线粒体功能的不同干预的影响。虽然这种方法可以提供对骨骼肌代谢的见解，但它也可以应用于其他器官，如肝脏、大脑、肾脏或几乎任何组织 在开始手术之前。为了分离骨骼肌，准备以下溶液，P-B-S-P-B-S 加 10 毫摩尔 EDTA、八倍线粒体缓冲液分离缓冲液 1 或 IB 1、分离缓冲液 2 或 IB 2 和实验缓冲液或 eb。
有关说明，请参阅随附的书面协议。接下来，打开离心机并将其设置为 4 摄氏度。打开水浴并将其设置为 37 摄氏度。
在一个漂亮的桶中，将三个 10 毫升烧杯、陶肘、宝石组织研磨机、小手术剪刀和 10 个微量离心管放在冰上。在整个实验过程中，一切都必须保持冰冷。将 IB 1 和 IB 2 放在 ICE 上，将 EB 放入温水浴中。
然后将以下溶液加入三个冰烧杯中，一个 10 毫升 PBS 烧杯，两个 10 毫升 P-B-S-E-D-T-A 烧杯。三。三毫升 ib。根据当地机构动物护理和果汁委员会批准的程序对大鼠实施安乐死。
接下来，用镊子和 Mayo Clinic 剪刀快速分离 250 至 500 毫克的骨骼肌。在 beca one 中冲洗，然后将其转移到 beca 2 中，以使肌肉均匀化。首先，将其转移到烧杯 3 中，最后用剪刀将其切碎。
将溶液转移到陶艺 Elva 宝石均质器中，使用电动杵将肌肉匀浆 10 次，始终将管子保持在冰中。接下来，将匀浆转移至预冷的 2 mL 微量离心机、试管中，并在 4 摄氏度下以 700 Gs 离心 10 分钟。将 S 上清液转移到新的预先填充的微量离心管中，弃去沉淀离心机。
S 上清液在 10， 500 Gs 下放置 10 分钟在 4 摄氏度下，将 SNAT 转移到新的预装微量离心管中，并用 SN one 和肌肉型 Reese 标记。将沉淀悬浮在 500 微升 IB 2 中，然后在 4 摄氏度下以 10、500 Gs 离心 10 分钟。将旋囊转移到新的预装微量离心管中，并用 SN 2 和 Muscle type 标记。
将最终线粒体沉淀悬浮在 100 微升 IB 2 中。以迷你 fuge 形式旋转几秒钟。如果有沉淀，将 supinate 转移到新的预装微量离心管中并丢弃沉淀氧电极的校准是该协议中的关键步骤，必须每天进行。
电极的校准可以在线粒体分离期间完成。首先，将 100 毫升蒸馏水加入 250 毫升培养瓶星形中，剧烈 20 分钟。为了平衡水与大气气体，用几滴 50% 氯化钾覆盖 GRAT 电极。
接下来，将一小块蓝色的 rizla 卷纸放在电极上。然后是一块 PTFE 膜。在卷纸的顶部。
使用套环器套上内环，然后将外环放入电极槽中。连接电极并组装更大的塑料环底座、线粒体腔和水管。打开 GRAT 框并启动 GRAS 软件。
将平衡的水加入线粒体室中。然后加入搅拌棒以打开搅拌棒。单击硬件。
然后搅拌一下。将速度调整为 60 并单击。接下来，开始一个新的实验。
单击 calibrate（校准），然后单击 Liquid phase calibration（液相校准）。对于方框 1，将温度更改为 37 摄氏度，然后单击 "确定" 两次。当 override 更改为 ， okay， click it 并打开氮气罐时。
将连接到氮气罐的尖端放入腔室中，并建立零氧。点击 确定 当它从 override 切换时。吸出水并向线粒体腔中加入 500 微升 EB
。用柱塞密封腔室。如果使用多个框，请从每个框的校准步骤中重复。启动一个新的实验，让它运行大约一分钟。
为了稳定信号，添加必要体积的线粒体悬浮液，使每个腔室达到 150 微克。标记事件并让它运行。加入 10 微升温热的 250 毫摩尔谷氨酸、125 毫摩尔苹果酸，使最终浓度为 5 毫摩尔谷氨酸、2.5 毫摩尔苹果酸标记，并让它运行一分钟。
这被定义为状态 2。接下来，添加 7.5 微升 10 毫摩尔 DP，最终浓度为 150 微摩尔。然后标记并让它运行 30 秒。
这被定义为状态 3。再加入 7.5 微升 10 毫摩尔 DP 标记，让它运行 1.5 分钟。加入 0.5 μL 冷的 10 毫摩尔寡核苷酸霉素，使最终浓度为 1 微摩尔标记，然后运行三分钟。
这被定义为状态 4。加入 1 微升冷的 0.1 毫摩尔 FCCP，使最终浓度为 0.2 微摩尔标记，然后让 RUM 发酵 3 分钟。这被定义为状态 5。
完成后，结束实验并保存。使用 raft 软件获取呼吸率。输入标准化因子。
如果添加 150 微克线粒体蛋白，则标准化因子将为 0.15。计算不同呼吸状态的归一化呼吸率。通过将状态 3 除以状态 4 来计算呼吸控制比率或 RCR。
该图显示了骨骼肌耗氧量的代表性轨迹。线粒体。电极信号稳定后，将线粒体样品添加到 GRAT 室中。状态二，呼吸从添加谷氨酸和苹果酸开始。
添加 A DP 会增加耗氧量。定义状态 3。呼吸 A TP 合成酶通过添加 liga mycin 来阻断以获得状态 4 呼吸。
最后，添加 FCCP 以解耦线粒体呼吸。此图显示了状态 2、3、4 和 5 的代表性耗氧率。计算每个实验的呼吸控制比或 RCR。
RCR 大于 4 被认为是可行的线粒体制备的证据 尝试此程序时。始终将线粒体样本保存在冰中很重要。遵循此过程。
可以执行其他方法，如蛋白质印迹，以回答其他问题，例如线粒体蛋白的含量。看完这个视频，你应该对如何分离线粒体和骨骼肌以及线粒体呼吸有一个很好的了解。
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概述
该协议描述了一种从骨骼肌中分离线粒体并测量其呼吸的程序。该方法允许通过氧气消耗分析评估线粒体功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢
背景
- 线粒体在能量生产中起着至关重要的作用。
- 了解线粒体呼吸对于研究代谢性疾病至关重要。
- 该协议基于既定方法进行了调整。
- 线粒体的分离对于准确测量其功能至关重要。
研究目的
- 从骨骼肌组织中分离线粒体。
- 测量线粒体呼吸速率。
- 分析不同线粒体呼吸状态下的氧气消耗。
使用的方法
- 从喷干大鼠分离骨骼肌。
- 肌肉组织的均质化。
- 通过离心分离线粒体。
- 使用Bradford测定法测定蛋白质浓度。
- 使用多图仪测量线粒体呼吸。
主要结果
- 从骨骼肌中成功分离线粒体。
- 定量评估线粒体呼吸。
- 结果表明在不同呼吸状态下氧气消耗有所不同。
结论
- 该协议有效地分离线粒体以进行呼吸研究。
- 研究结果有助于理解线粒体在代谢过程中的功能。
- 该方法可应用于肌肉代谢的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating functional mitochondria from skeletal muscle enables mechanistic de-risking of metabolic targets in preclinical discovery. Quantitative respiration readouts provide predictive confidence for target validation and pathway interrogation. This method supports early go/no-go decisions by establishing mitochondrial viability thresholds before compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial function to skeletal muscle metabolism and energy homeostasis.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized isolation of viable mitochondria with RCR ≥4 as a functional benchmark.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying respiratory control ratios that reflect mitochondrial integrity and coupling efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial systems for downstream biochemical and functional assays including enzyme activity and proteomics.
- Operational Value: Ensures assay standardization via daily oxygen electrode calibration and consistent protein normalization using Bradford assay.
- Scalability Value: Enables reliable compound evaluation through reproducible state 2-5 respiration measurements under controlled substrate and inhibitor conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by studying mitochondrial respiration in skeletal muscle, a key tissue in metabolic disorders.
- Operational Value: Provides translational continuity from discovery through preclinical validation via quantitative oxygen consumption across respiration states.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions by measuring uncoupled (state 5) and ATP-linked (state 3) respiration to assess bioenergetic health.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting mitochondrial-targeted programs in metabolic disease.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mitochondria to clarify pathways involved in ATP synthesis and metabolic signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible respiration measurements that enable comparison of compound effects on oxygen consumption.
- Analytics: Generates quantitative readouts (state 2-5 respiration, RCR) that help teams compare conditions and assess mitochondrial function.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing functional mitochondrial data relevant to muscle metabolism and energy expenditure models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and respiration platform applicable across skeletal muscle types and adaptable to other tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial viability, reduction of mechanistic ambiguity in energy metabolism studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial isolation and respiration assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on respiratory control ratios and substrate-specific respiration profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques, centrifugation, and respiration measurement.
- Dependent on instrumentation including homogenizers, centrifuges kept at 4°C, water baths at 37°C, and polarographic oxygen electrode systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer preparation, daily electrode calibration, and strict ice-cold sample handling.
- Adaptation considerations include adjusting muscle input (250-500 mg) and mitochondrial protein load (150 µg) across different skeletal muscle types.
- Practical limitations include the need for fresh reagents, short functional study window (~1 hr post-isolation), and daily calibration of oxygen electrodes.
