骨骼肌的线粒体分离

本实验的总体目标是分离线粒体并进行线粒体呼吸测定。首先从喷雾dly大鼠中分离骨骼肌，然后将肌肉组织匀浆化，并通过离心法分离线粒体。

然后使用 Bradford 法测定蛋白质浓度。最后，通过多通道生理记录仪测量线粒体呼吸。最终可获得结果显示通过不同线粒体呼吸状态的耗氧量。

该方法有助于回答骨骼肌研究领域中的关键问题，例如不同干预措施对线粒体功能的影响。尽管该方法可用于研究骨骼肌代谢，也可应用于肝脏、脑、肾或几乎任何其他组织。在开始实验前，为分离骨骼肌，需配制以下溶液：磷酸盐缓冲液（P-B-S）、含10毫摩尔EDTA的P-B-S、线粒体分离缓冲液一（又称IB一）、分离缓冲液二（又称IB二）以及实验缓冲液（eb）。

请参阅随附的书面实验方案以获取操作说明。接下来，打开离心机并将其温度设置为 4 °C。打开水浴锅并将其温度设置为 37 °C。

在一个合适的容器中，将三个 10 毫升烧杯、Potter 匀浆器、Gem 组织研磨器、小型手术剪刀和 10 个微量离心管置于冰上。整个实验过程中，所有物品必须始终保持冰冻状态。将 IB1 和 IB2 放在冰上，EB 放入温水浴中。

然后将以下溶液加入置于冰上的三个烧杯中：烧杯一，10 毫升 PBS；烧杯二，10 毫升 PBS-EDTA；烧杯三，3 毫升 ib。一。按照当地机构动物护理与使用委员会批准的程序处死一只大鼠。

接下来用镊子和梅奥剪刀迅速分离250至500毫克骨骼肌组织。在烧杯一中冲洗，然后转移至烧杯二中以匀浆化肌肉组织。首先将其转移至烧杯三，最后用剪刀剪碎。

将溶液转移至 Potter-Elvehjem 匀浆器中，使用电动研杵在冰上匀浆肌肉组织 10 次，全程保持离心管处于冰上。接着，将匀浆液转移至预冷的 2 毫升微量离心管中，在 4°C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟。将上清液（S）转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀物。

在4 °C条件下，将S上清液以10,500 ×g离心10分钟，将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN1和肌肉类型Reese。将沉淀重悬于500 µL的IB2中，然后在4 °C条件下以10,500 ×g离心10分钟。将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN2和肌肉类型。

将最终的线粒体沉淀重悬于 100 微升 IB2 中。在微型离心机中离心数秒。若有沉淀，则将上清液转移至新的预装微量离心管中，并弃去沉淀。氧电极的校准是本方案中的关键步骤，必须每天进行。

在分离线粒体的过程中可完成电极的校准。首先，将 100 毫升蒸馏水加入 250 毫升的烧瓶中，剧烈搅拌 20 分钟。为使水与大气气体达到平衡，用几滴 50% 氯化钾覆盖 GRAT 电极。

接下来，将一小片蓝色Rizla卷纸放在电极上方，然后在其上放置一片PTFE膜。

使用环状施用器安装内环，然后将外环置于电极槽中。连接电极，并组装较大的塑料环形底座、线粒体室和水管。打开 GRAT 箱并启动 GRAS 软件。

将平衡后的水加入线粒体室中。然后加入搅拌子以启动搅拌。单击硬件。

然后以一定速度搅拌。将速度调节至60并点击开始。接着，开始一项新实验。

单击校准，然后选择液相校准。对于第一箱，将温度更改为37摄氏度，然后单击两次“确定”。当“覆盖”变为“确定”时，单击它并打开氮气罐。

将连接至氮气罐的探针插入腔室，并建立零氧环境。当系统从“覆盖”状态切换后，点击“确定”。吸除水相，向线粒体腔室中加入 500 µL EB 溶液。

用活塞密封腔室。如果使用多个盒子，请对每个盒子从校准步骤开始重复操作。启动新实验并运行约一分钟。

为稳定信号，向每个腔室中加入适量的线粒体悬液，使蛋白量达到150微克。标记该事件并继续运行。一分钟后，加入10微升预热的250毫摩尔谷氨酸和125毫摩尔苹果酸，使终浓度为5毫摩尔谷氨酸和2.5毫摩尔苹果酸，标记该事件，继续运行一分钟。

此步骤定义为状态二。接下来，加入7.5 µL的10 mM dNTP，使其终浓度为150 µM。然后标记并运行30秒。

此定义为状态三。加入另外 7.5 µL 的 10 mM ADP，运行 1.5 分钟。加入 0.5 µL 的冷 10 mM 寡霉素，终浓度为 1 µM，运行 3 分钟。

此定义为状态四。加入一微升冷的、0.1毫摩尔的FCCP，使终浓度达到0.2微摩尔标记，然后让RUM反应三分钟。此定义为状态五。

实验结束后，终止实验并保存数据。使用筏式软件获取呼吸速率，并输入归一化因子。

若加入150微克线粒体蛋白，则归一化因子为0.15。计算不同呼吸状态下的归一化呼吸速率。通过将三态呼吸速率除以四态呼吸速率，计算呼吸控制比（RCR）。

该图展示了骨骼肌线粒体耗氧量的代表性记录。在电极信号稳定后，将线粒体样品加入 GRAT 反应室。状态二呼吸通过添加谷氨酸和苹果酸启动。

加入ADP可增加耗氧量，从而定义三态呼吸。通过添加寡霉素抑制ATP合酶，以获得四态呼吸。

最后，加入FCCP以解偶联线粒体呼吸。该图显示了状态2、3、4和5的代表性耗氧速率。每次实验均计算呼吸控制比（RCR）。

RCR 大于 4 被视为线粒体制备具有活性的证据。在进行该实验操作时，必须始终将线粒体样品置于冰上。完成该操作步骤后。

还可以进行其他方法，如蛋白质印迹（Western blots），以回答有关线粒体蛋白含量等进一步的问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何从骨骼肌中分离线粒体，以及如何开展线粒体呼吸实验。