从植物中提取的病原体的单细胞基因表达分析

取自感病植物中分离的致病细菌悬液。

细菌基因组包含一个转录融合结构，其中毒力调控基因的启动子同时驱动其下游无启动子的荧光蛋白基因的表达。

在植物感染过程中，启动子激活会触发调控蛋白和荧光蛋白的产生。

调控蛋白可激活毒力基因，而荧光则提供了毒力激活程度的可测量读出信号。

离心细胞，弃去上清液，然后重悬以获得浓缩的悬浮液。

在盖玻片上滴加一滴样品，并覆盖琼脂糖垫以铺展并固定细胞。

拍摄明场图像以识别所有细菌细胞，然后拍摄荧光图像以检测单细胞荧光。

合并两者以显示荧光强度差异，从而揭示具有高、低或无毒力基因表达的亚群。

这种表型变异反映了一种适应性策略，可增强细菌在植物定植过程中的存活能力。

进行单细胞分析时，用蒸馏水配制1.5%的琼脂糖溶液。待其融化后，加入足够体积的溶液，填充并排放置的两张显微镜载玻片之间的空隙，并在上方再放置一张载玻片。静置15分钟，然后小心移去最上方的载玻片。

使用刀片将琼脂糖垫切割成 5 毫米 × 5 毫米的小块，备用。同时，离心 1 毫升从质外体提取的细菌。用移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 20 微升水中，以浓缩细胞。

取2微升浓缩的细胞液滴加到0.17毫米的盖玻片上，然后用一块琼脂糖垫覆盖液滴。在共聚焦显微镜下观察细菌样品，使用特定激光识别绿色荧光细菌。通过明场成像识别所有细菌，并将明场与荧光图像合并。