基于荧光的口腔厌氧菌活力评估

从一支密封试管开始，其中含有在厌氧条件下保存的富含营养的肉汤。

使用移液器将少量培养基转移到另一根试管中。

取一个含有厌氧口腔细菌菌株菌落的血琼脂平板，挑取单个菌落并将其重悬于肉汤中。

将悬液重新放回密封管中，并进行孵育以促进细菌生长。

用缓冲液稀释培养物，以获得用于细胞活力评估的最佳细胞浓度。

加入含有膜通透性染料和膜不通透性染料的溶液，然后孵育。

可渗透性染料进入所有细胞并与细胞内核酸结合。

这种不透性染料只能穿透细胞膜受损的死细胞，并与它们的核酸结合。

使用流式细胞术分析样品。

死细胞表现出明显的红色荧光，而活细胞仅显示绿色荧光，从而可评估细菌的活力。

首先，对培养基进行高压灭菌，然后加入 5 µg/mL 的血红素和 1 µg/mL 的甲萘醌。将 9 mL 培养基分装至 Hungate 管中，并用橡胶塞和铝帽密封试管。随后用含 90% 氮气和 10% 二氧化碳的混合气体对试管进行通气处理。

使用注射器吸取1毫升厌氧培养基，转移至1.5毫升微量离心管中。挑取每种细菌的单菌落，并将其重悬于培养基中。然后将菌落接种至改良的厌氧BHI培养基中，在37°C下培养48小时。

孵育结束后，使用滤膜除菌的 PBS 将培养物稀释至每毫升含 10⁵ 个细胞。然后采用 SYBR Green/碘化丙啶染色结合流式细胞术检测细胞数量。评估微生物群落组成及细胞活性对于避免实验中的偏差至关重要。