从叶片中提取总DNA以检测细菌感染

从感染了细菌性病原体的韧皮部的小块冷藏叶片组织开始。

将组织块放入研钵中，并加入液氮以抑制降解DNA的核酸酶活性。

研磨以机械破坏细胞并释放细胞内组分。

使用预冷的刮刀转移粉末，加入裂解缓冲液，涡旋振荡悬浮液。

孵育以裂解植物细胞核和细菌细胞，释放DNA和RNA，同时使蛋白质变性。

加入RNase并孵育以降解RNA。

加入蛋白质沉淀缓冲液以聚集蛋白质，然后离心分离。

将含有植物和细菌DNA的上清液转移至异丙醇中，使DNA沉淀为丝状物。

离心以收集DNA，并弃去上清液。

用乙醇洗涤，然后离心，弃去上清液。

将DNA风干，然后加入重悬缓冲液并孵育以溶解。

DNA 样本现已准备好用于后续基于 PCR 的病原体检测。

使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一整片新鲜叶片，并放入干净的塑料三明治袋中。然后，加入少量液氮以冷却研钵和研杵。接着，用剪刀将叶片组织剪成小块，每块大小约为一平方英寸。

将叶片碎片放入研钵中，立即进行冷冻。迅速开始用研钵研磨叶片组织，直至液氮蒸发，得到细嫩的绿色粉末。接着，将金属刮勺在液氮中冷却10至15秒。然后用冷却的刮勺将研磨好的组织转移到1.5毫升微量离心管中。使用1000微升移液器向样品中加入600微升细胞核裂解液。随后涡旋振荡样品1至3秒。将离心管置于65摄氏度水浴中孵育15分钟。

孵育结束后，使用10微升移液器向裂解液中加入3微升RNase溶液，以去除RNA。然后通过倒置离心管2至5次，混匀管内物质。将样品置于37摄氏度的培养箱中孵育15分钟。孵育15分钟后，向样品中加入200微升蛋白质沉淀溶液。高速涡旋振荡离心管20秒。

接下来，将样品在13000 g条件下离心3分钟。在离心过程中，向一个新的1.5毫升微量离心管中加入600微升室温保存的异丙醇。离心结束后，小心地将离心管中的上清液转移至含有异丙醇的试管中。弃去沉淀物。

将离心管倒置，使DNA呈现为丝状可见。接着，在室温下以13000 g离心1分钟。

离心后，将上清液小心倾倒除去。然后，向沉淀中加入 600 微升 70% 乙醇。反复倒置离心管数次以洗涤沉淀。在 13000 g 条件下离心 1 分钟。离心结束后，小心吸除上清液。随后，将管盖打开，倒置于吸水纸上，静置晾干 15 分钟。干燥后，向沉淀中加入 100 微升 DNA 溶解液。将 DNA 悬液置于 65 摄氏度水浴中孵育 1 小时。