表达抗凋亡细菌蛋白的宿主细胞中凋亡抑制作用的免疫印迹分析

取一份SDS-PAGE凝胶，其中含有表达CaeB（一种抗凋亡细菌蛋白）的细胞裂解物以及不表达CaeB的对照细胞裂解物中的已分离蛋白。

两种细胞均携带一种抗生素诱导型表达系统，并用抗生素处理以诱导促凋亡蛋白的表达。

在对照细胞中，这会触发凋亡信号通路，激活凋亡标志物。

在表达 CaeB 的细胞中，CaeB 抑制凋亡信号通路，减少凋亡标志物的活化。

利用电场将蛋白质从凝胶转移至膜上。

加入封闭液以减少非特异性抗体结合。

使用靶向活化凋亡标志物的一抗进行孵育。

洗涤以去除未结合的抗体。

加入与一抗结合的酶标记二抗进行孵育。再次洗涤后，加入化学发光底物，该底物与酶反应产生光信号。

对膜进行成像。

与对照细胞相比，表达 CaeB 的细胞中信号减弱，表明 CaeB 在促凋亡蛋白的下游抑制细胞凋亡。

使用转印印迹 SD 半干式转移系统，在恒定电压 16 伏特下将蛋白质转印至 PVDF 膜上，持续 60 分钟。随后，在室温下用 10 毫升 MPT 溶液封闭膜 1 小时。

将7微升抗裂解PARP抗体加入7毫升MPT中稀释。将PVDF膜置于抗体溶液中，4摄氏度孵育过夜。移除抗体溶液，用含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗涤三次，每次10分钟。将膜与1.4微升辣根过氧化物酶标记的二抗加入7毫升MPT中稀释，室温孵育1小时。

孵育结束后，用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤膜三次。根据试剂盒说明书，使用商用试剂盒检测辣根过氧化物酶活性，并采用标准设备进行胶片显影以观察蛋白条带。