在囊性纤维化患者痰液样本中可视化Pseudomonas aeruginosa

取一支含有固化水凝胶的试管，该水凝胶中包埋有来自囊性纤维化患者痰液的样本。

痰液中含有与感染相关的Pseudomonas aeruginosa，一种致病性细菌。

加入含有绿色荧光探针的杂交缓冲液，孵育以使探针选择性结合至细菌核糖体RNA。

用洗涤缓冲液冲洗，以去除未结合的探针。

加入新鲜洗涤缓冲液并孵育，以稳定探针结合。

移除缓冲液，然后加入封闭缓冲液以防止非特异性相互作用。

移除封闭缓冲液。加入含有红色荧光抗体的溶液，孵育以使抗体靶向细菌胞外多糖。

用缓冲液冲洗以去除未结合的抗体，然后使用DNA结合染料对DNA进行标记。

将染色的水凝胶安装到带有盖玻片的灌流腔室中。

在共聚焦显微镜下，观察被红色荧光标记的胞外多糖包围的绿色荧光标记细菌，可清晰地可视化痰液中的细菌。

将水凝胶样品从保存溶液中取出，并置于无菌表面。使用无菌解剖刀将水凝胶切成约一毫米厚的切片，并将切片放入1.5毫升离心管中。在1.5毫升离心管中配制一毫升杂交缓冲液，然后加入荧光标记的PseaerA探针，通过颠倒混匀。

向每个切片中加入 200 至 500 微升杂交缓冲液，确保水凝胶样品完全浸没。将样品置于黑暗环境中，在 46 摄氏度下静置杂交约 18 至 24 小时。随后，向各管中加入 1 毫升新鲜洗涤缓冲液，并在 48 摄氏度下避光孵育 6 小时。向水凝胶样品中加入 500 微升含 2% BSA 的 PBS 溶液，以阻断非特异性蛋白结合。然后，将样品在黑暗条件下过夜孵育。

第二天，通过将抗体稀释于500微升新鲜的含2% BSA的PBS中，配制终浓度为0.112微克/毫升的Psl0096-Texas Red抗体溶液。将抗体溶液加入水凝胶样品中，并在避光条件下孵育六小时。

接下来，将水凝胶样品与250微升RIMS溶液和10微克/毫升DAPI混合，在避光条件下轻轻振荡孵育过夜，以进行DAPI染色。

染色后，将样品置于0.9或1.7毫米的灌流腔室中，并用玻璃盖玻片密封。使用25、40、63或100倍放大倍数进行共聚焦激光扫描显微镜观察。