通过噬菌体介导的可切除抗生素盒转移在 E. coli 中实现基因缺失

取含有受体 E. coli、氯化钙和噬菌体颗粒的悬浮液。

噬菌体携带带有可切除抗生素抗性盒的供体DNA。

孵育过程中，氯化钙可促进噬菌体吸附至受体细胞。噬菌体将供体DNA注入细胞后即脱离。

携带可切除抗生素抗性盒的供体DNA取代了目标基因区域，导致基因缺失。

加入螯合剂以结合氯化钙，抑制噬菌体的进一步吸附。

离心以分离细菌与未吸附及脱落的噬菌体。移除上清液。

将细菌重悬于新鲜的螯合剂补充培养基中。

重复洗涤以去除残留的污染物。

再次在含有螯合剂的培养基中重悬，并在振荡条件下孵育。

离心并弃去上清液。

重悬沉淀，然后将其涂布于添加了抗生素和螯合剂的营养丰富的琼脂培养基上，并进行培养。

抗生素抗性菌落的形成表明受体菌的转导成功 E. coli 基因敲除

进行P1转导时，将受体菌株在LB培养基中培养至600纳米处的光密度为1，然后在混匀条件下向受体菌株培养物中加入氯化钙至终浓度为10毫摩尔。接着，取适量上清中的噬菌体裂解液（避免转移氯仿），加入1毫升受体菌培养物中，使感染复数达到0.5，并在37摄氏度下静置孵育20分钟。

孵育结束时，加入柠檬酸钠至终浓度为 100 毫摩尔每升以终止感染，然后离心转导后的细菌。

在转导后加入柠檬酸钠是至关重要的一步，因为它可防止野生型噬菌体的进一步感染。

将沉淀重悬于1毫升新鲜LB培养基中，该培养基需添加100毫摩尔的柠檬酸钠，再洗涤细胞两次，以确保彻底去除游离的噬菌体和钙离子。

最后一次洗涤后，将细菌重悬于1毫升新鲜LB培养基中，加入100毫摩尔的柠檬酸钠，在30摄氏度、100转/分钟条件下孵育1小时。孵育结束后，通过离心收集细菌，并将菌体沉淀重悬于约100微升含有100毫摩尔柠檬酸钠的LB培养基中。

然后，将细菌涂布于含有 25 微克/毫升卡那霉素和 10 毫摩尔柠檬酸钠的 LB 琼脂平板上，并在 30 摄氏度下培养细菌直至菌落出现。