分析香烟烟雾对肺上皮细胞抗菌防御功能的影响

取人肺上皮细胞培养物。这些细胞可分泌抗菌肽（AMPs），作为抵御呼吸道病原体的防御屏障。

对一组细胞用香烟烟雾提取物（CSE）处理；另一组不处理，仅添加培养基。

CSE组分进入细胞，与细胞内受体结合，并触发信号传导，从而减少AMP的产生，削弱细胞的防御能力。

将两种培养物与一种呼吸道致病菌共同孵育。

在未处理组中，抗菌肽可杀死大部分细菌，从而维持较低的感染水平。

在CSE处理组中，抗菌肽（AMPs）减少，导致更多细菌得以存活并侵入上皮细胞。

加入抗生素以清除胞外细菌，然后洗涤去除抗生素。

加入裂解缓冲液以破坏宿主细胞并释放内化的细菌。将稀释后的裂解液接种到平板上，孵育以促进细菌生长。

CSE 处理组中较高的菌落数表明，香烟烟雾暴露会损害抗菌肽介导的细菌杀伤作用。

以每毫升3×10⁵个细胞的浓度接种肺上皮细胞，每孔加入总体积为2毫升的培养基。将培养板置于培养箱中过夜孵育。当细胞融合度达到约80%时，弃去原培养基，更换为含1% FBS的Heights培养基。

然后，向孔中加入 4% CSE，并将培养板孵育 3 小时。向经 CSE 处理的肺上皮细胞各孔中加入 Pseudomonas。随后，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育培养板 1 小时。

接下来，将六孔板中的培养基更换为2毫升含有4% CSE和100微克/毫升庆大霉素的新鲜Heights培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时后，吸去各孔中的培养基。用2毫升冷的PBS对经庆大霉素处理的细胞洗涤两次。

随后可通过平板落点法、定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）或流式细胞术检测肺上皮细胞中的细菌载量。向每孔肺上皮细胞中加入一毫升细胞裂解缓冲液。对细胞裂解液进行系列稀释，稀释比例范围从1:10至1:10,000。

然后接种TSB琼脂平板。经过16小时培养后，通过计数细菌菌落数量，确定肺上皮细胞中存在多少菌落形成单位。