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微生物学
0 次观看 • 4:29 分钟 • July 1st, 2026
取感染了致病菌 Pseudomonas syringae 的 Arabidopsis thaliana 植物的叶片。
从采集的叶片上切取小的叶圆片。
将两个叶圆片放入含有金属研磨珠和盐溶液的研磨管中。
密封试管并开始匀浆。
在匀浆过程中，金属球通过机械作用裂解叶片组织，释放细胞内容物及细菌。
在多孔板中对匀浆液进行连续稀释。
将每个稀释度的少量液体接种到富含营养的琼脂平板上。
让液滴被充分吸收，然后在培养板上加盖盖子。
倒置并在适宜条件下培养，以促进细菌菌落形成。
从最低稀释度开始计数菌落数量，以避免菌落重叠。
通过测定每片叶盘的菌落形成单位（CFU）数量，评估感染叶片中的细菌载量。
定量病原菌生长前一天，将150毫米×15毫米的KB培养基平板预先干燥。
将培养板在室温下放置约24小时以干燥。在感病基因型的感染组织出现黄化所指示的褪绿症状后，但在坏死病斑形成之前，处理感染组织。每种基因型准备六个研磨管。
在每个试管中放入一颗不锈钢研磨珠，并加入 500 µL 无菌的 10 mM 氯化镁溶液。接着，从植株上取下被感染的叶片，使用直径为 1 孔的打孔器 punched 出叶盘。用镊子将来自两株不同植物的两片叶盘随机放入每个研磨管中。密封试管，然后使用高通量组织研磨仪以最大速度匀浆组织 10 分钟。
如有需要，重复此步骤，直至组织充分匀浆，且溶液因感病叶片释放叶绿素而变为绿色。在等待匀浆过程中，向96孔细胞培养板前六行的每孔中加入180微升10毫摩尔氯化镁溶液。将20微升研磨后的组织悬液转移至96孔板第一行的各孔中，并通过反复吹打液体使其充分混匀。
如果组织碎片堵塞了枪头，可剪去尖端2至3毫米，以帮助准确吸取溶液的体积。为了在培养皿顶部留出足够的空间放置液滴，请将不同基因型的组织样本交替放置在不同的行中。进行十倍梯度稀释时，将20微升组织悬液转移至第二行，并重复此操作直至第六个稀释梯度。使用分装的移液枪头，将96孔板中的20微升溶液转移至150毫米×15毫米的KB培养皿上。
从最稀释的悬液开始操作，逐步至最浓的悬液，这样在稀释过程中无需更换移液器吸头。将平板盖子稍打开，在室温下干燥。当平板表面观察不到液体时，盖上盖子，倒置平板，并在室温下孵育。
将平板孵育 40 至 60 小时，直至菌落可见。确认平板上的细菌表现出可预测的每十倍稀释菌落形成单位的下降。
在细菌过度生长且菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下不重叠菌落数量的细菌数目。通常宜选择含有 10 至 50 个菌落的稀释度进行计数，不同技术重复之间该稀释度可能有所差异。
为计算细菌增殖水平，使用以下公式确定每片叶盘的菌落形成单位（colony forming unit）数量，其中 R 代表行数，T 代表每个技术重复中的细菌数量。随后利用该数据绘制图表，每个数据点表示六个技术重复的均值，并以对数尺度呈现。
误差线表示平均值的 95% 置信区间。