系统感染后小鼠脾脏和肝脏中细菌载量的定量

从感染了胞内细菌病原体的小鼠中获取脾脏和肝脏组织开始实验。

这些器官作为免疫过滤器发挥作用，在全身性感染期间可聚集被组织驻留的吞噬细胞捕获的细菌。

将每个器官放入含有非离子型去污剂和玻璃珠的裂解缓冲液管中，以促进组织破碎。

通过机械振荡试管，使珠子反复撞击组织，从而破坏其结构。

该去垢剂可使宿主细胞通透化，但不会溶解细菌细胞壁，从而将完整且具有活性的细菌释放到悬浮液中。

对每种匀浆液进行连续稀释，以获得一系列细菌浓度。

将每个稀释度的等分试样涂布于营养丰富的琼脂平板上。

孵育平板，使单个细菌生长形成明显的菌落。

计数菌落以确定每个组织样本中的细菌载量。

为了测定峰值感染菌量，在感染后第三天，将实验动物仰卧固定于解剖板上并限制其四肢，然后用70%乙醇对皮肤进行消毒。

使用无菌的硬质剪刀，从胸部向腹股沟做一切口。然后从腹股沟中点分别向两侧膝盖、从胸部中点分别向两侧肘部做切口。钝性分离并翻起皮肤，用25号针头将其固定张开。

用70%乙醇再次消毒肌层。然后使用无菌精细剪刀，在腹膜壁上做正中切口。用镊子夹住剑突。

从剑突开始，在腹膜壁两侧分别做切口，沿肋骨走向向外侧延伸至膈肌下方，即可暴露肝脏。

接下来，使用无菌剪刀从一个叶中切取约100毫克的组织块。将组织放入已预称重的1.5毫升微量离心管中，管内含有0.2至0.3克经酸洗的无菌1.5至2毫米玻璃珠，并用镊子轻轻拨开腹腔左侧的器官，以暴露脾脏。

用镊子轻轻夹住脾脏，剪除周围结缔组织，将器官从腹腔中分离出来。将脾脏置于与肝脏不同的试管中，并将组织样本放入含有冰块的防漏容器内，转运至实验室。使用珠磨匀浆器时，以30赫兹频率振荡试管3分钟。

然后，将匀浆液在含0.1% Triton X-100的PBS中进行十倍系列稀释。接着，用无菌涂布棒将每种稀释后的匀浆液各100微升涂布于BHI琼脂平板上。将平板置于37°C培养箱中，过夜培养。

保留每个平板上菌落数量不超过300个的平板。计数每个平板上的菌落。