小鼠脾细胞体外热灭活刺激 单核细胞增生李斯特菌

从感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的小鼠中获取脾细胞，制备成单细胞悬液开始实验。

该悬液含有免疫细胞，包括抗原呈递细胞和T细胞。

细胞悬浮于含有血清蛋白的培养基中，以维持细胞活性。

现在，将悬浮液接种到含有热灭活单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的多孔板中。

孵育期间，抗原提呈细胞会吞噬并处理细菌，然后将细菌来源的抗原呈递在MHC分子上。

T细胞受体识别并结合MHC上的这些细菌抗原，

这会激活T细胞并触发细胞因子释放。

接着，加入囊泡运输的蛋白抑制剂并进行孵育。

在T细胞内，该抑制剂阻断囊泡运输，从而阻止进一步的细胞因子释放。

收集含有细胞因子的培养基。

加入缓冲液，并分别收集细胞。

含有细胞因子的培养基和收获的细胞已准备好进行后续分析，以评估单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）诱导的T细胞细胞因子产生情况。

为了检测CD4和CD8 T细胞的干扰素γ反应，按照上述方法，取感染了2×10⁴ CFU病原体的小鼠的脾脏。

将脾脏处理成单个红细胞的活细胞悬液，并用含胎牛血清的完全RPMI培养基重悬细胞沉淀，使细胞浓度为每毫升4×10⁶个细胞。接着，将1毫升细胞悬液接种至24孔板的每个孔中，同时加入等体积已解冻并经热灭活的L. monocytogenes，然后将培养物置于37°C培养箱中培养。

20小时后，向各孔中加入每毫升0.66微升的蛋白质转运抑制剂，并将培养板放回培养箱。4小时后，在生物安全柜中收集500微升培养上清液，并将样品于-80摄氏度冷冻，用于后续通过ELISA检测干扰素γ。

然后将细胞转移至一个无菌的15毫升离心管中，用PBS洗涤各孔，并将洗涤液与收集的细胞合并，用于流式细胞术染色和分析。