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微生物学
0 次观看 • 4:22 分钟 • July 1st, 2026
取一培养物，为志贺氏菌（Shigella），一种致病性细菌。
将细菌悬液和培养基加入培养板中已分化的类人结肠上皮单层细胞。
离心以促进细菌与上皮细胞之间的直接接触。
孵育以促进细菌内化。
用缓冲液洗涤以去除细胞外细菌。
加入含抗生素的培养基。孵育期间，抗生素可选择性地清除胞外细菌，而不会影响胞内细菌。
移除培养基。用缓冲液洗涤细胞，以去除死亡的细菌。
添加新鲜的含抗生素培养基，以防止交叉污染。
孵育以使内化的细菌增殖。
移去培养基，并用缓冲液洗涤细胞。
加入含去垢剂的缓冲液以裂解含有细菌的上皮细胞。
刮取裂解的细胞，并收集到微量离心管中。
涡旋以释放裂解细胞中的细菌。
回收的细菌可用于后续分析。
首先，取过夜培养的Shigella菌液并涡旋混匀。将100 µL菌液加入含有5 mL新鲜TSB培养基的培养管中。在37°C、250 RPM振荡条件下培养菌液，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.7。
将两次培养的志贺氏菌（Shigella）各十的八次方个菌落形成单位转移至2毫升微量离心管中。在室温下以17,000 g离心2分钟，使细胞沉淀。吸除上清液。
加入1毫升预热的PBS，充分重悬沉淀。再次离心细胞后，将沉淀重悬于2毫升预热的DMEM中，并涡旋混匀细胞悬液。然后，向6孔板中HT-29结肠上皮单层细胞的每孔加入1毫升重悬的Shigella菌液和1毫升DMEM。
为确保细菌与HT-29细胞充分接触，将六孔板在室温或37摄氏度下以2,000 g离心10分钟。将六孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育45分钟。孵育结束后，吸除每孔中的培养基。向每孔加入1毫升预热的PBS，轻轻洗涤。
然后，每孔加入 2 毫升含 50 微克/毫升庆大霉素的预温 DMEM 培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。用 1 毫升 PBS 缓冲液洗涤感染的 HT-29 细胞 3 次。每孔加入 2 毫升含庆大霉素的预温 DMEM 培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育最多 24 小时，以促进胞内复制。
孵育结束后，用 1 毫升 PBS 洗涤细胞两次。每孔加入含 1% Triton X-100 的 1 毫升 PBS 以裂解 HT-29 细胞。然后使用细胞刮刀或弯头移液器吸头，将裂解的细胞从孔底刮下，并将混合液转移至 1.7 毫升微量离心管中。
将每管涡旋振荡至少30秒，以进一步使Shigella从裂解的真核细胞中分离。用PBS对裂解液进行10倍系列稀释。取100微升系列稀释液接种于含TSB的刚果红平板，37摄氏度过夜培养。