评估细菌病原体在小鼠腹腔巨噬细胞中的存活情况

取小鼠腹腔巨噬细胞培养物，并引入细菌病原体。

孵育以使细菌通过吞噬作用被巨噬细胞摄取，细菌在细胞内改变降解途径并存活。

去除上清液，并用缓冲液洗涤以去除细胞外细菌。

加入含有庆大霉素抗生素的培养基，并孵育以清除任何残留的胞外细菌。

洗涤感染的巨噬细胞并机械剥离。收集细胞，离心后弃去上清液。

加入溶菌酶并孵育，以裂解任何残留的胞外细菌。

离心并弃去上清液。洗涤细胞，离心后移除上清液。

重悬细胞并进行分装。加入去垢剂裂解细胞，释放胞内细菌。用缓冲液对裂解液进行系列稀释，并将稀释后的样品滴加到琼脂平板上。

孵育以促进细菌菌落形成。计数菌落以评估细菌在巨噬细胞内的存活情况。

将腹腔巨噬细胞与 Staphylococcus aureus MRSA-252 培养两小时。移除上清液，用 PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 1 毫升含 100 微克/毫升庆大霉素的完全 DMEM 培养基，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育两小时。

孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。使用细胞刮刀将腹腔巨噬细胞收集至 50 毫升离心管中。在 1000 g 条件下离心 5 分钟。

向感染了胞内 MRSA-252 的巨噬细胞中加入终浓度为 10 µg/mL 的溶菌酶，37°C 孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 1 mL PBS 中。随后取出约 20 µL 分装样品，加入 0.1% Triton X-100 处理 5 分钟以裂解细胞。

用PBS对裂解的细胞悬液进行系列稀释，并将其滴加到胰蛋白酶大豆琼脂平板上。在37摄氏度下将平板孵育过夜。次日，计数细菌菌落，以计算腹腔巨噬细胞内的MRSA-252细菌数量。