从感染的巨噬细胞中分离含有磁珠标记细菌的吞噬体

取含有还原剂、酶抑制剂和细胞骨架破坏化合物的吞噬体分离缓冲液中的巨噬细胞单层。

这些巨噬细胞预先感染了用生物素标记并结合链霉亲和素磁珠的细菌。

孵育过程中，还原剂可防止蛋白质氧化，而酶抑制剂可阻断蛋白酶活性，从而保护吞噬体蛋白。细胞骨架破坏性化合物会破坏膜的稳定性，有助于细胞破裂。

使用含有渗透稳定剂的缓冲液替换，以保持吞噬体的形态。

刮取细胞，并将巨噬细胞悬液收集至预冷的离心管中。

反复通过针头抽吸悬浮液，以彻底破坏巨噬细胞膜，同时保持吞噬体的完整性。

将悬液置于磁力架上。在磁场作用下，含有磁珠标记细菌的吞噬体将附着在管壁上。

移去上清液，并将吞噬体重悬于新鲜缓冲液中。

重复磁力分离，并弃去含有碎片的上清液。

将含有细菌的分离吞噬体在缓冲液中重悬，用于后续分析。

首先，在使用前加入 DTT 和细胞松弛素 B 配制所需体积的吞噬体分离缓冲液 A，并根据制造商的建议加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在预定时间点吸去感染细胞的培养基，用预热至室温的无菌 PBS 洗涤细胞。

然后向培养皿中加入 750 微升吞噬体分离缓冲液 A，冰上孵育 20 分钟。注意期间需偶尔摇动培养板。接着加入 250 微升吞噬体分离缓冲液 B，随后轻轻摇动培养板，确保缓冲液完全覆盖表面。

使用橡胶刮棒轻轻刮取细胞，将细胞从培养皿上脱离，并转移至预冷的 1.5 毫升离心管中。随后，用 1 毫升注射器将细胞悬液至少通过 26 号针头推注 15 次。接着，将细胞悬液置于磁力架上静置 5 分钟。

附着在磁珠上的颗粒是含有包被的S.Typhimurium的吞噬体。将含有其余细胞组分的悬液转移至新标记为“胞质溶胶”的1.5毫升离心管中。从支架上取下含有分离吞噬体的离心管，并用1毫升无菌PBS重悬。

将试管放回磁力架上静置5分钟，然后吸除PBS。用PBS重复洗涤一次后，再次移除PBS，最后重悬细胞 S. Typhimurium 含有吞噬体的所需缓冲液。