克隆分离及PCR筛选保留靶基因的GFP切除型重组疱疹病毒

从感染了重组疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞（CEFs）混合群体开始。

在一个群体中，病毒基因组包含目标基因和GFP报告基因。在另一个群体中，GFP经过位点特异性切除后，病毒基因组仅保留目标基因。

使用荧光激活细胞分选技术，将一个GFP阴性且已感染的CEF分选至含有未感染CEF的孔中。

孵育以促进病毒复制，导致CEF细胞裂解及病毒向邻近细胞扩散。

孵育后，加入酶以解离细胞，将悬液转移至离心管中，离心。

弃去上清液，并将沉淀重悬于裂解缓冲液中以释放DNA。

将DNA转移至含有基因特异性引物的PCR反应体系中。

进行PCR 扩增目标基因。

将PCR产物上样至琼脂糖凝胶，进行电泳，并在紫外光下观察。

与目标基因相对应的正确大小的扩增片段可证实该基因保留在GFP切除的重组疱疹病毒中。

感染后72小时，按照先前所述方法制备细胞用于分选。将单个无荧光细胞分选至预先接种了CEF的96孔板中。随后，用胰蛋白酶消化所选的蚀斑，并按照文本方案中所述步骤重悬相应细胞。

将一半的细胞接种至已预先接种第二代CEF细胞的96孔板的每个孔中。将每个克隆的剩余细胞在200 × g下离心5分钟。弃去上清液，加入50 µL裂解缓冲液重悬细胞，用于DNA提取。

然后，按照文本方案所述，使用1微升DNA模板和5'连接引物进行PCR。根据PCR结果，选取3至5个重组HVT阳性克隆进行后续传代和验证。