准备细胞以分析抗病毒药物的细胞内摄取与活性

从培养在多孔板盖玻片上的人肝癌细胞开始。

这些细胞的细胞质中含有丙型肝炎病毒基因组，可产生对病毒基因组复制至关重要的病毒蛋白。

在对照孔中，仅使用培养基维持细胞；而在实验孔中，加入抗病毒剂乳铁蛋白。

孵育该培养板，使乳铁蛋白通过内吞作用进入细胞并在细胞质中积累。

在细胞质内，乳铁蛋白会破坏病毒蛋白，从而阻止病毒基因组的进一步复制。

在对照孔中，病毒基因组复制为负链RNA中间体，随后这些中间体被用于产生正链RNA拷贝，作为病毒蛋白质合成的模板。

处理后，用缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的乳铁蛋白。

加入含有蔗糖的固定液。孵育以固定并稳定细胞。

细胞现已准备好用于分析治疗剂的细胞内摄取及其抗病毒活性。

首先，将圆形盖玻片放入24孔板每个孔的底部，并用PBS清洗各孔。在DMEM培养基中接种携带HCV复制子的HUH-7细胞，接种密度为每孔5 × 10⁴个细胞，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠和250 mg/mL G-418。将细胞在37 °C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。

第二天，用3微摩尔的人乳铁蛋白或从人乳中纯化的HLF处理细胞，并分别孵育0、2或24小时。配制含蔗糖的多聚甲醛（PFA）溶液时，将350毫升PBS加入烧杯中，加热至20至30摄氏度，加入60克蔗糖并使其溶解，随后将60克PFA溶于该溶液中。然后缓慢加入3至7毫升2摩尔/升的氢氧化钠，直至获得澄清溶液。用盐酸调节pH至7.4后，用PBS定容至500毫升。

然后，使用Whatman滤纸通过重力过滤该溶液。使用前，加入PBS将溶液稀释至4% PFA和4%蔗糖。在HLF处理后的预定时间，用PBS洗涤细胞两次，每次1分钟，并用稀释后的PFA-蔗糖溶液在室温下固定细胞20分钟。