感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

取一个含有已透化的病毒感染的上皮细胞单层的盖玻片。

病毒会形成双链RNA（dsRNA）中间体，这些中间体被核蛋白包裹。这些中间体可被胞质内的模式识别受体（PRRs）所识别。

加入用封闭剂稀释的一抗混合液。孵育。

dsRNA 特异性抗体可检测病毒的 dsRNA，而 PRR 特异性抗体则结合宿主的胞质受体。

用缓冲液洗涤。

加入绿色和红色荧光标记的二抗，孵育以结合相应的初抗，然后洗涤。

加入品红荧光标记的抗体并孵育，以直接检测病毒核蛋白。洗涤。

加入 DAPI 以染色细胞核。

加入非离子型去污剂以去除非特异性结合的荧光标记抗体。

用缓冲液和水洗涤，以去除去污剂残留物。

将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固并密封。

在共聚焦显微镜下，观察红色荧光与绿色和洋红色信号的共定位，以确认病毒双链RNA与宿主细胞质PRR之间的相互作用。

孵育结束后，吸除培养基，每孔用1 mL含钙和镁的PBS洗涤细胞。

吸除 PBS 后，每孔加入 1 mL 预冷至 -20°C 的甲醇，于 -20°C 孵育 15 分钟以固定细胞。

然后去除甲醇，并向每孔中加入 1 mL PBS。

在 4°C 条件下轻轻振荡洗涤样品 5 分钟，重复此洗涤步骤，共洗涤四次。

在 4°C 条件下，每孔加入 1 mL 0.2% t-辛基苯基聚氧乙烯醚，轻轻摇晃孵育 5 分钟，进一步洗涤细胞。

然后移除液体，每孔加入 1 mL PBS，在 4°C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟，重复此步骤，共洗涤四次。

为了检测双链RNA和MDA5，加入200 µL用3% BSA稀释的一抗，于4°C轻轻振荡孵育过夜。

然后去除一抗，每孔加入 1 mL PBS，在室温下轻轻摇动孵育 5 分钟，洗涤一次，再重复洗涤四次。

然后加入200 µL用3% BSA稀释的二抗，室温下避光孵育1小时，同时轻轻振荡。

去除二抗后，每孔加入 1 mL PBS，在室温下轻轻摇动孵育 5 分钟，重复洗涤四次。

然后通过加入 DAPI 对盖玻片进行复染，并在室温下轻轻摇动孵育 3 分钟。

用 1 mL 0.5% t-辛基苯基聚氧乙烯醚按每孔洗三次，每次 5 分钟，室温下轻轻摇动。

每孔加入 1 mL PBS，室温下轻轻摇动，每次 5 分钟，共洗两次。

然后用1 mL双蒸水洗涤一次₂每孔室温轻柔振荡孵育1分钟。

染色和洗涤完成后，取一滴封片液将盖玻片封固于载玻片上，避光、室温孵育过夜。

然后用指甲油封片，并在空气中干燥1小时。

使用60倍放大倍数和数值孔径为1.42的油浸物镜，在共聚焦显微镜下对样品进行成像，确保每个样品使用相同的激光发射参数，然后进行分析。