基于荧光的重组痘苗病毒检测与纯化

取一个含有成纤维细胞培养物的微孔板。
获取感染了痘苗病毒的成纤维细胞。该病毒经过基因改造，可编码红色荧光蛋白（RFP）。
涡旋震荡以裂解细胞并释放病毒。
用培养基稀释裂解液，并将其加入各孔中。
孵育，使病毒结合成纤维细胞表面受体并进入细胞内。
病毒在细胞质内复制，产生新的病毒颗粒。
这会导致细胞裂解，释放出的病毒进一步扩散并感染邻近细胞，形成空斑。
利用荧光显微镜检测每个空斑内感染细胞中的RFP，以指示病毒蛋白的表达。
吸除培养基，并标记空斑的位置。
使用含有少量培养基的移液器吸头刮取并吸出标记的空斑，然后转移至冻存管中。
重复此步骤以最大化病毒回收率。
将冻存管置于超低温条件下保存，用于后续分析。

开始第一轮修饰型VV纯化时，将15块六孔板每孔接种300,000个未修饰的CV-1细胞。次日，将转染后的CV-1细胞冻存悬液在37摄氏度下解冻三分钟，然后剧烈涡旋振荡30秒以裂解细胞。随后，将一微升裂解液用三毫升DMEM稀释。

将此稀释液0.5 mL加入至每孔未修饰的CV-1细胞培养板中。随后，将培养板放回培养箱中孵育两天。两天后，使用荧光显微镜鉴定RFP阳性噬斑，可用10X物镜观察识别。

确定后，使用记号笔在培养皿底部准确标记噬斑。现在为每个待收获的阳性噬斑准备一支含有200微升无血清DMEM的冻存管。

接下来，重要的是吸出含有标记斑块的孔板中的全部培养基。然后，将200微升移液器设定为吸取30微升，先用移液器吸取冻存管中10微升培养基，随后刮取斑块，并利用剩余的吸液体积将细胞一并吸入。将吸取物排入冻存管中，并重复此操作两次，始终针对同一个RFP阳性斑块，以尽可能收集更多的细胞。将收集的样品置于负80摄氏度保存。