一种用于测量病毒株相对复制适合度的检测方法

取一培养物的人类血液免疫细胞，加入等体积的原型病毒株与突变株的混合液。
保留部分接种物，用于测定初始病毒株比例。
在孵育过程中，病毒进入宿主细胞，并将其基因组释放至细胞质中。
随后，更换大部分培养基，离心并弃去上清液，以去除未结合的病毒。
加入新鲜培养基并继续孵育。在感染的细胞内，病毒基因组表达并产生新的病毒颗粒，这些病毒颗粒被释放到培养基中。
在固定时间间隔，收集部分培养基，离心后保存含有病毒颗粒的上清液，用于定量分析。
向培养物中补充新鲜培养基，并继续孵育以维持病毒的产生。
绘制病毒株比例随时间变化的曲线，比较初始与后续各时间点的病毒株比例。若某一病毒株的比例呈持续上升趋势，则表明其相对复制适应性高于另一病毒株。

为进行生长竞争实验，将三份各10的5次方个PHA刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）接种于48孔平底培养板中，每孔总体积为500微升。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育，直至接种。接下来，制备3毫升接种物，每种病毒含6,000 IU。

在典型的实验中，通常会测试多个突变株，但为了本演示的目的，仅将一个突变株与原型病毒进行对比测试。正确制备病毒接种物是该实验流程中的关键步骤。若病毒储备液的感染性滴度非常高，则可能需要对其进行系列稀释。将每种病毒接种物各1.5毫升转移至无菌试管中，以制备双重感染接种物。

向48孔板的每孔PHA刺激的PBMC中加入500微升双感染接种物，每孔终体积为1毫升。将双感染接种物每孔200微升分装至两个96孔板中，用于RNA提取，并将其中一个板作为备份保存。

将接种后的细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育16至24小时。接种后16至24小时，洗涤培养物，移除并弃去750微升培养上清液。加入750微升新鲜的完全Iscove改良Dulbecco培养基（cIMDM）。

用封口膜包裹培养板，在 300 g 条件下离心 10 分钟。移除并弃去 750 微升上清液。加入 750 微升新鲜 cIMDM 培养基。将培养板置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的环境中孵育。采样时间点的选择应至少包含病毒指数生长期内的三个时间点。

采集样本时，将500微升培养上清液转移至1.8毫升离心管中，在3000 g 条件下离心1分钟。取200微升无细胞上清液加入两个96孔样本板中用于RNA提取，并保留其中一个板作为备份。将上清液于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。

向每孔培养物中加入 500 µL 新鲜的 cIMDM，然后将培养板放回培养箱中，直至下一次取样时间。随后，从样品中提取 RNA，进行 cDNA 合成。