利用基于荧光素酶的假病毒感染实验确定最佳靶细胞密度

0 次观看3:09 分钟 • July 31st, 2026

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从一块含贴壁哺乳动物细胞的多孔板开始,细胞密度依次递增。
向各孔中加入等浓度的假病毒并进行孵育。
该假病毒在慢病毒核心表面携带流感病毒包膜蛋白,并包含一个编码荧光素酶的基因。
病毒与细胞表面受体结合后发生内吞作用。
进入细胞内后,病毒RNA被释放,并由逆转录酶逆转录为DNA;随后DNA整合至宿主基因组,从而表达荧光素酶。
移除培养基,并用缓冲液洗涤细胞。
加入裂解缓冲液并在低温下孵育。裂解试剂可破坏细胞并释放荧光素酶。
使裂解液恢复至室温,然后转移至不透光的多孔板中。
加入荧光素酶底物。荧光素酶催化底物氧化反应,产生发光信号。
使用发光仪检测发光强度,以定量病毒侵染水平。
比较不同细胞密度下的发光强度。最高发光信号表明该细胞密度为感染效率最佳的条件。

进行假病毒滴定,将 MDCK 细胞用完全 DMEM 培养基制成单细胞悬液,浓度为每毫升含 5 × 10⁴ 个细胞。

将1,250、2,500、5,000、10,000、20,000和40,000个细胞分别加入平底96孔板的不同孔中。孵育后,解冻假病毒并涡旋混匀。向96孔圆底板的每孔加入6 HAU的假病毒,并用完全DMEM补足至每孔120 µL。

取100微升混合物加入96孔板中的细胞。将培养板分别孵育48、60和72小时以进行病毒感染,并进行荧光素酶检测。进行荧光素酶检测时,小心移除培养基,用200微升PBS洗涤细胞。

尽可能吸除 PBS,然后向每个孔中加入 50 毫升裂解缓冲液。次日,将培养板在室温下平衡 2 小时。随后轻轻摇动培养板数次,将全部细胞裂解液转移至不透光的 96 孔板中。向每孔加入 50 微升底物,并充分混匀。使用化学发光仪检测假病毒的荧光素酶滴度。

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最后更新:1 八月 2026