小鼠视网膜冷冻切片的制备以评估腺相关病毒对视网膜的通透性

取自视网膜屏障受损的小鼠模型的眼球，该小鼠预先注射了携带绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒。

受损的视网膜屏障允许腺相关病毒（AAV）穿透感光细胞，病毒基因组在细胞内表达产生绿色荧光蛋白（GFP），从而使细胞呈现荧光。

解剖眼球以去除角膜和晶状体，保留眼杯完整。

将眼杯浸入固定液中以保存视网膜结构。

将眼杯依次转移至浓度递增的冷冻保护剂溶液中。随后，在最终浓度溶液中孵育，以防止冰晶形成。

将眼杯置于冷冻介质中并进行冷冻。

使用冷冻切片机将眼杯切成薄片。

将切片置于载玻片上。加入含有去污剂的缓冲液以通透组织，便于后续免疫染色时抗体进入。

用缓冲液漂洗切片。使用封闭液处理，以防止免疫染色过程中抗体的非特异性结合。

视网膜冷冻切片已准备好进行后续的免疫染色和荧光成像。GFP阳性荧光细胞表明病毒转导成功，提示视网膜具有通透性。

从安乐死后的注射动物中取出眼睛后，解剖眼睛以去除晶状体和角膜。随后将解剖后的眼球在4%多聚甲醛中浸泡固定一小时。一小时后，在室温下用10%蔗糖对眼球进行冷冻保护处理一小时。然后在室温下用20%蔗糖浸泡眼球二十分钟。

最后，将眼球置于30%蔗糖溶液中，在4°C下过夜。次日，使用包埋介质（如Cryo-matrix）包埋并冷冻眼杯。然后使用冷冻切片机切出10 µm的切片，并将其贴附于专用于冷冻组织切片的载玻片上。

现在用去垢剂对载玻片上的切片进行透化处理，持续五分钟。随后用 PBS 短暂洗涤两次。然后在室温下封闭眼组织一小时。