重组乙型肝炎病毒颗粒的制备与纯化

从培养在胶原蛋白包被培养皿上的肝细胞开始。

引入与两种质粒复合的转染试剂：一种携带修饰的乙型肝炎病毒（HBV）基因组，另一种编码病毒结构蛋白。

孵育以促进质粒进入细胞。在细胞内，病毒基因表达产生结构蛋白和修饰的HBV基因组，二者组装形成重组HBV颗粒。

更换培养基并继续培养，以支持病毒颗粒的产生与释放。

收集培养基并离心，以沉淀细胞碎片。

收集上清液，并过滤以去除残留的碎片。

接着，加入聚乙二醇和氯化钠以沉淀病毒颗粒。

离心沉淀内容物。将沉淀溶于缓冲液中，再次离心去除碎片。然后将上清液铺在蔗糖垫上。

通过垫层进行超速离心以沉淀病毒颗粒。

弃去上清液，并将沉淀重悬于培养基中。

将悬浮液过滤后，于低温保存纯化的重组乙型肝炎病毒，用于后续分析。

在准备细胞培养基后，转染前一天，将4 × 10⁶个 HepG2 细胞加入培养基中，接种于10 cm的胶原蛋白包被培养皿。将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育。按照转染试剂生产商的说明，使用转染试剂将5 µg pUC1.2HBVΔε和5 µg pUC1.2HBV/NL转染至细胞中。

第二天，移除培养基并加入 10 mL 新鲜培养基。转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 mL 离心管中。

随后收集培养基并在 2,300 × g 条件下离心 5 分钟，以去除含有重组 HBV 的细胞碎片。将上清液通过 0.45 µm 膜滤器过滤。然后向滤液中加入等体积的 25% PEG、1.5 M NaCl，并轻轻混匀。

将样品在 4 °C 下孵育过夜。次日，在 4 °C、2,300 × g 条件下离心溶液 20 分钟。弃去上清液，将沉淀溶解于 0.5 mL TNE 缓冲液中，然后将含有重组 HBV 的 0.5 mL TNE 溶液加样至含 0.8 mL 20% 蔗糖（溶于 TNE）的离心管中。

在 100,000 × g 及 15 °C 条件下离心两小时，尽可能弃去上清液，每 40 mL 初始培养基使用 1 mL 无血清 DMEM 重悬沉淀。将悬液于 4 °C 过夜孵育。次日早晨，通过 0.45 µm 滤膜过滤悬液，分装为 0.5 mL 每管，于 -80 °C 保存。