一种用于研究沙粒病毒与宿主细胞结合的体外实验方法

从表达病毒进入受体的贴壁培养的哺乳动物肾上皮细胞开始。

将细胞置于冰上孵育，以抑制内吞作用，防止细胞表面受体的内化。

孵育后，移除培养基，并用预冷的缓冲液洗涤细胞。

将冰冻的沙粒病毒颗粒悬液加入细胞中，并在冰上孵育。

病毒表面糖蛋白特异性结合宿主细胞表面的受体，启动沙粒病毒进入细胞的第一步。

在低温下，仅发生病毒的表面附着，而病毒的内化过程则被阻断。

孵育后，去除未结合的病毒颗粒，并用预冷缓冲液洗涤，以保留仅附着在表面的病毒颗粒。

细胞现在可用于定量表面结合的病毒颗粒。

配制完全DMEM培养基时，向500毫升DMEM培养基中加入50毫升热灭活的胎牛血清，以及各5毫升的100倍浓度青霉素-链霉素溶液和100倍浓度HEPES缓冲液。实验当天，将Vero E6细胞以每孔2.5 × 10⁴个细胞的密度接种于48孔组织培养板中，每种病毒设三个复孔，每孔终体积为500 µL完全DMEM培养基。将培养板置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育10至18小时。

在 II 级生物安全柜中，使用预冷的完全 DMEM 培养基，将待检测的 JUNV Candid 1 病毒样品稀释至每毫升含 200 到 2,000 个病灶形成单位或空斑形成单位。在本实验方案的后续部分，空斑形成单位将简称为 PFU。例如，若需以 50 微升含 2,000 PFU 的病毒液进行复孔接种，则需将 4,800 PFU 加入总体积为 120 微升的培养基中。

将样品置于冰上保存，直至准备加入Vero细胞培养物。从37摄氏度培养箱中取出培养板，置于冰上或4摄氏度环境中15分钟，以抑制已接种细胞的内吞作用。随后，吸除每孔中的完全DMEM培养基，并用100微升预冷的PBS迅速洗涤每孔两次。

然后将50 µL预稀释的病毒样品加入相应的孔中。用塑料膜包裹板子，并立即放回冰上或4 °C环境中孵育60至90分钟，以使病毒完成吸附。在此步骤中，始终保持洗涤缓冲液和病毒样品处于4 °C。

孵育结束后，吸除病毒接种液，用 200 µL 冰冷的 PBS 每孔洗涤三次。