质粒介导的培养细胞中重组轮状病毒的生成

从含有编码轮状病毒全套基因的重组质粒混合物的试管开始，该混合物位于减血清培养基中。
加入转染试剂以促进质粒的摄取。
将转染混合物逐滴加入多孔板中成纤维细胞单层表面，并轻轻摇动培养板。
孵育以允许质粒进入细胞，从而启动病毒RNA的转录和蛋白质的合成。
由此形成未成熟的病毒颗粒，这些颗粒保留在细胞内或松散地附着于细胞表面。
接下来，覆盖上皮细胞——轮状病毒的天然靶细胞——以支持病毒复制。
加入胰蛋白酶以切割与细胞表面相关病毒颗粒的外层衣壳蛋白。
切割可激活病毒颗粒，使其进入上皮细胞并建立有效感染。
进行反复冻融循环以裂解细胞并释放重组病毒颗粒。
将裂解液转移至离心管中，离心以沉淀细胞碎片。
收集含有重组轮状病毒的上清液，用于后续实验。
在12孔细胞培养板的每孔中接种2 × 10⁵个细胞，加入1 mL GMEM培养基。将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中过夜孵育。
次日，根据实验方案准备用于转染的质粒混合物。然后，向每份质粒混合物中加入110 µL预热的减血清培养基，轻轻吹打混匀。向混合物中加入32 µL转染试剂。
涡旋后短暂离心，并在室温下孵育20分钟。同时，用2 mL不含血清的GMEM培养基冲洗BHKT7细胞。每孔加入1 mL不含血清的SMEM培养基，将培养板放回培养箱。
20分钟孵育结束后，使用200 µL移液器将转染混合物逐滴加入各孔中。轻轻摇动培养板后放回培养箱。
向转染后的BHKT7细胞孔中逐滴加入0.25 mL MA104细胞悬液。
通过向每孔加入0.8 µL浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶储备液，将胰蛋白酶终浓度调整为0.5 µg/mL。转染后第六天，从转染细胞中回收重组病毒。
在无菌条件下对共培养的BHKT7和MA104细胞进行三次冻融循环，将培养板在-20°C冰箱与室温之间交替转移。将裂解液转移至1.5 mL离心管中。在4°C条件下以500 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。收集上清液并储存在4°C。